Пролиферация кубического эпителия шейки матки: Пролиферация кубического эпителия — Вопрос гинекологу

Рис. 2.12

Развитие зоны трансформации от жизни плода к жизни в постменопаузе.

2.2. Эктропион или эктопия

Эктропион или эктопия определяется как наличие вывернутого эндоцервикального цилиндрического эпителия на эктоцервиксе. Он выглядит как большая красноватая область на эктоцервиксе, окружающая внешний зев ().Выворот столбчатого эпителия обычно более выражен на передней и задней губах эктоцервикса и менее выражен латерально. Это нормальное физиологическое явление. Иногда столбчатый эпителий распространяется до свода влагалища. Вся слизистая оболочка, включая крипты и поддерживающую строму, смещается в эктропионе. Это область, в которой происходит физиологическое преобразование в плоскоклеточную метаплазию, и эта область восприимчива к плоскоклеточному поражению шейки матки.

2.3. Плоская метаплазия

Физиологическое замещение вывернутого столбчатого эпителия плоским эпителием называется плоской метаплазией. Влагалищная среда относительно кислая во время репродуктивной жизни и во время беременности. Считается, что кислотность играет роль в плоскоклеточной метаплазии. Обнаженные столбчатые клетки в конечном итоге замещаются метапластическим плоским эпителием. Первоначально раздражение обнаженного цилиндрического эпителия кислой влагалищной средой приводит к появлению субколоночных резервных клеток, и эти клетки пролиферируют, вызывая гиперплазию резервных клеток и в конечном итоге превращаясь в метапластический плоский эпителий.Резервные клетки размножаются, дифференцируются и, в конечном итоге, отрываются от столбчатого эпителия (). Точное происхождение резервных ячеек неизвестно.

Рис. 2.13

Развитие плоского метапластического эпителия. (а) Стрелки указывают подстолбцы резервных ячеек. (б) Размножаются резервные клетки. (c) Резервные клетки далее размножаются и дифференцируются. (d) Зрелый сквамозный (подробнее …)

Первым признаком сквамозной метаплазии является появление и разрастание резервных клеток ().Первоначально это выглядит как один слой маленьких круглых клеток с темными ядрами, расположенный очень близко к ядрам столбчатых клеток, которые в дальнейшем размножаются, вызывая гиперплазию резервных клеток (). Морфологически резервные клетки похожи на базальные клетки исходного плоского эпителия с округлыми ядрами и небольшой цитоплазмой. По мере прогрессирования метапластического процесса резервные клетки пролиферируют и дифференцируются, образуя тонкий многоклеточный эпителий незрелых плоских клеток без признаков расслоения ().Термин «незрелый плоский метапластический эпителий» используется, когда в этом тонком новообразованном метапластическом эпителии мало или совсем нет расслоений. Незрелый плоский метапластический эпителий не производит гликоген и, следовательно, не окрашивается в коричневый или черный цвет йодом Люголя. На этой стадии можно увидеть группы столбчатых клеток, содержащих муцин, встроенными в незрелый плоский метапластический эпителий.

Одновременно могут возникать многочисленные сплошные и / или изолированные поля или очаги незрелой плоской метаплазии.Было высказано предположение, что базальная мембрана исходного столбчатого эпителия растворяется и реформируется между пролиферирующими и дифференцирующимися резервными клетками и цервикальной стромой. Плоскоклеточная метаплазия обычно начинается в исходной SCJ на дистальном пределе эктопии, но она также может возникать в столбчатом эпителии рядом с этим соединением или в виде островков, разбросанных в обнаженном столбчатом эпителии.

По мере продолжения процесса незрелые метапластические плоские клетки дифференцируются в зрелый многослойный метапластический эпителий ().Практически это напоминает оригинальный многослойный плоский эпителий. Некоторые остаточные столбчатые клетки или вакуоли слизи видны в зрелом плоском метапластическом эпителии, который содержит гликоген из промежуточного слоя клеток и далее. Таким образом, чем более зрелая метаплазия, тем больше она окрашивается в коричневый или черный цвет после применения йода Люголя ().

Рис. 2.14

Поглощение йода Люголя шейкой матки у женщины в пременопаузе.

Кисты включения, также называемые наботианскими фолликулами или наботианскими кистами, могут наблюдаться в TZ в зрелом метапластическом плоском эпителии ().Наботианские кисты представляют собой ретенционные кисты, которые развиваются в результате окклюзии эндоцервикального отверстия крипты или выхода вышележащего метапластического плоского эпителия. Заглубленный столбчатый эпителий продолжает выделять слизь, которая в конечном итоге заполняет кисту и раздувает ее. Столбчатый эпителий в стенке кисты уплощен и в конечном итоге разрушается под давлением находящейся в нем слизи. Выходы крипт столбчатого эпителия, еще не покрытые метапластическим эпителием, остаются стойкими отверстиями крипт ().Наибольшую протяженность метапластического эпителия на эктоцервикс можно лучше всего оценить по расположению отверстия крипты, наиболее удаленного от SCJ. представляет собой схематическое изображение компонентов нормальной ткани TZ.

Рис. 2.15

Наботианский фолликул виден в позиции 7 часов на этом изображении нормальной зоны трансформации. На его конце видно небольшое отражение света.

Рис. 2.16

Эпителиальные компоненты зоны трансформации.

Плоскоклеточная метаплазия — необратимый процесс; трансформированный эпителий (теперь плоский по характеру) не может превратиться в столбчатый эпителий.Метапластический процесс в шейке матки иногда называют непрямой метаплазией, поскольку столбчатые клетки не трансформируются в плоскоклеточные клетки, а заменяются пролиферирующими субколоночными кубовидными резервными клетками. Плоскоклеточная метаплазия может прогрессировать с разной скоростью в разных областях одной и той же шейки матки, и, следовательно, в метапластическом плоском эпителии с островками цилиндрического эпителия или без них можно увидеть много областей разной степени зрелости. Метапластический эпителий, прилегающий к SCJ, состоит из незрелой метаплазии, а зрелый метапластический эпителий находится рядом с исходной SCJ.

Дальнейшее развитие новообразованного незрелого метапластического эпителия может идти по двум направлениям. У подавляющего большинства женщин он развивается в зрелый плоский метапластический эпителий, который во всех практических целях похож на нормальный гликоген-содержащий исходный плоский эпителий. У очень небольшого количества женщин может развиться атипичный диспластический эпителий. Некоторые онкогенные типы ВПЧ могут инфицировать незрелые базальные плоские метапластические клетки и, в редких случаях, превращать их в предраковые клетки.Неконтролируемая пролиферация и разрастание этих атипичных клеток может привести к образованию аномального диспластического эпителия, который может регрессировать до нормального состояния, сохраниться в виде дисплазии или прогрессировать до инвазивного рака через несколько лет, в зависимости от того, может ли ВПЧ-инфекция превратиться в инфекцию. трансформирующая инфекция (см. главу 4).

2.4. Зона трансформации (TZ)

TZ — это область эпителия, которая находится между нативным и непораженным цилиндрическим эпителием эндоцервикального канала и нативным плоским эпителием, происходящим из влагалищного и эктоцервикального плоского эпителия ().

Рис. 2.17

(а) Принципиальная схема зоны нормальной трансформации. (б) Схематическая диаграмма аномальной или атипичной зоны трансформации, содержащей дисплазию.

Эверсия эндоцервикального эпителия изнутри эндоцервикального канала на внешнюю часть шейки матки, то есть эктоцервикс, происходит в разное время и с разной скоростью, но в целом это происходит в подростковом возрасте и во время первой беременности (). В результате столбчатый эпителий эктоцервикса подвергается воздействию относительно кислой среды влагалища и претерпевает плоскоклеточную метаплазию, производя физиологическую ТЗ, как описано выше.Этот процесс, когда он завершен, вероятно, приводит к защите от инфекции HPV, но во время этого процесса динамический TZ чувствителен к инфекции HPV, в результате чего он может инфицировать базальные слои эпителия в TZ и, в небольшой части случаев, инициировать разработка CIN (). Почему этот диспластический эпителий развивается у одних женщин, а не у других, в настоящее время неясно, но в 99% случаев он связан с онкогенными типами ВПЧ. Большинство людей будут инфицированы онкогенными типами ВПЧ на ранних этапах своей нормальной половой жизни, но подавляющее большинство излечится от инфекции без последствий (см. Главу 4).Когда TZ становится ненормальным или атипичным, это называется атипичным TZ. Компоненты TZ также изображены в .

Рис. 2.18

Влияние инфекции онкогенным ВПЧ на незрелый плоский эпителий.

TZ различается по размеру и точному положению на шейке матки, и он может частично или полностью лежать в эндоцервикальном канале. Где он находится и насколько заметен, определите его тип (см. Приложение 1). У большинства женщин репродуктивного возраста TZ относится к типу 1, и увеличенное изображение с освещением, обеспечиваемое кольпоскопией, обычно дает кольпоскописту четкое изображение всех компонентов TZ, а также нативного плоского эпителия и нативный и нетрансформированный столбчатый эпителий эндоцервикального канала ().Иногда (примерно в 4% случаев) обследование выявляет так называемые оригинальные или врожденные ЗТ, как показано в .

Рис. 2.19

Типичная зона врожденной или исходной трансформации (ЗП).

2.4.1. Зона врожденной трансформации

На раннем этапе развития эмбриона кубовидный эпителий влагалищной трубки заменяется плоским эпителием, который начинается в каудальном конце дорсального мочеполового синуса. Этот процесс завершается задолго до рождения, и вся длина влагалища и эктоцервикса обычно покрыта плоским эпителием.Этот процесс очень быстро проходит по боковым стенкам, а затем по передней и задней стенкам влагалища. Если эпителизация протекает нормально, исходная ВПС при рождении будет располагаться у наружного зева. Если этот процесс по какой-либо причине остановлен или не завершен, исходная ВПС будет расположена дистальнее наружного зева или может редко располагаться на стенках влагалища, особенно в передних и задних сводах. Оставшийся здесь кубовидный эпителий подвергнется плоской метаплазии.Это позднее преобразование в плоский эпителий передней и задней стенок влагалища, а также эктоцервикса приводит к формированию врожденной TZ. Таким образом, это вариант внутриутробной плоской метаплазии, при котором дифференцировка плоского эпителия не полностью завершена из-за нарушения нормального созревания. На поверхности наблюдается чрезмерное созревание (о чем свидетельствует кератинизация) с задержкой, неполное созревание в более глубоких слоях. Клинически это может рассматриваться как обширная беловато-серая гиперкератотическая область, простирающаяся от передней и задней губ шейки матки до свода влагалища.Постепенное созревание эпителия может происходить в течение нескольких лет. Этот тип ТЗ встречается менее чем у 5% женщин и является вариантом нормального ТЗ.

ВПЧ16-иммортализованные клетки из зоны трансформации человека и эндоцервикса более диспластичны, чем эктоцервикальные клетки в органотипической культуре

Чувствительность эпителиальных клеток, культивируемых из разных областей шейки матки человека, к иммортализации, индуцированной ВПЧ16

Abstract

Стойкая инфекция, вызванная вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, является основным фактором риска рака шейки матки.Более 90% этих видов рака возникают в зоне трансформации шейки матки (TZ), узкой области метапластического плоского эпителия, которая развивается в плоскоколонном соединении между эктоцервиксом и эндоцервиксом. Неясно, почему TZ имеет высокую восприимчивость к злокачественной трансформации, и в нескольких исследованиях конкретно изучались клетки из этой области. Мы предположили, что клетки, культивируемые из TZ, более восприимчивы к клеточной иммортализации, изменению, которое способствует злокачественному развитию.Мы культивировали первичные эпителиальные клетки из каждой области шейки матки человека (эктоцервикс, эндоцервикс и TZ) и измеряли чувствительность к иммортализации после трансфекции полным геномом HPV-16 или инфицирования ретровирусами HPV16 E6 / E7. Клетки, культивируемые из каждой области шейки матки, экспрессировали маркеры кератина (кератин 14 и 18), которые подтверждали область их происхождения. В отличие от нашего прогноза, клетки из TZ были одинаково восприимчивы к иммортализации, как и клетки из эктоцервикса или эндоцервикса. Таким образом, повышенная восприимчивость ТЗ к цервикальному канцерогенезу не связана с увеличением частоты иммортализации ВПЧ-16.Мы разработали серию иммортализованных клеточных линий HPV16 из эктоцервикса, эндоцервикса и TZ, которые позволят сравнивать реакцию этих клеток на факторы, способствующие канцерогенезу шейки матки.

Образец цитирования: Deng H, Hillpot E, Yeboah P, Mondal S, Woodworth CD (2018) Чувствительность эпителиальных клеток, культивируемых из разных областей шейки матки человека, к иммортализации, индуцированной ВПЧ16. PLoS ONE 13 (6): e0199761. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761

Редактор: Сюэфэн Лю, Джорджтаунский университет, США

Поступила: 1 февраля 2018 г .; Одобрена: 13 июня 2018 г .; Опубликовано: 26 июня 2018 г.

Авторские права: © 2018 Deng et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные содержатся в бумажных файлах и / или файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа финансировалась за счет награды Национального института рака 1R15CA173703-01 (CDW) и премии US Biomax, Inc (CDW). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Эта работа финансировалась за счет награды Национального института рака 1R15CA173703-1 (CDW) и премии US Biomax, Inc.(CDW). Это не влияет на нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Рак шейки матки является ведущей причиной смерти от рака у женщин во всем мире [1], а стойкая инфекция типами ВПЧ высокого риска, такими как ВПЧ16, является основным фактором риска этого заболевания [2,3]. Онкогены HPV E6 и E7 избирательно сохраняются и экспрессируются почти во всех формах рака шейки матки. Гены Е6 и Е7 ВПЧ16 высокого риска достаточны для иммортализации эпителиальных клеток шейки матки [4], а иммортализация клеток является важным ранним шагом в злокачественном развитии [5].Хотя инфицирование типами ВПЧ высокого риска необходимо для рака шейки матки, этого недостаточно. Инфекции ВПЧ часто возникают у сексуально активных женщин, но большинство из них распознается иммунной системой и устраняется [6]. Непонятно, почему некоторые инфекции ВПЧ высокого риска прогрессируют до рака, а многие другие — нет.

Хотя инфекции ВПЧ высокого риска возникают по всей шейке матки и влагалище [7], около 90% рака шейки матки развивается в небольшой анатомической области [8], известной как зона трансформации шейки матки (ЗТ).Эта область находится между многослойным плоским эпителием эктоцервикса и столбчатым эпителием эндоцервикса (рис. 1). TZ состоит из метапластических плоских клеток, полученных из стволовых клеток (резервных клеток) эндоцервикса. Хотя большинство рака шейки матки происходит из TZ, неясно, почему эта область так восприимчива к злокачественному превращению. Было предложено несколько гипотез, включая наличие локального подавления иммунитета в этой области [9], повышенную экспрессию рецепторов эстрогена на метапластических эпителиальных или стромальных клетках [10], повышенную пролиферацию клеток и нестабильную дифференцировку метапластических клеток [11] или повышенную концентрация стволовых клеток в ТЗ [12].Было проведено ограниченное исследование клеток из TZ, чтобы понять их повышенный риск канцерогенного развития. Мы исследовали гипотезу о том, что эпителиальные клетки, культивируемые из TZ, более восприимчивы к иммортализации HPV16 высокого риска, чем клетки окружающей эктоцервикса или эндоцервикса. Мы использовали три различных анализа иммортализации с полным геномом HPV16 или ретровирусами, кодирующими онкогены HPV16 E6 и E7. В отличие от нашего прогноза, мы обнаружили, что клетки TZ были одинаково восприимчивы к иммортализации HPV16, как и клетки эктоцервикса или эндоцервикса.

Рис. 1. Строение и гистология шейного отдела позвоночника.

A. Схематическое изображение шейки матки, показывающее ТЗ между эктоцервиксом и эндоцервиксом. B. Гистология шейки матки показывает многослойный плоский эпителий и лежащие в основе наботианские кисты. C. Схема, показывающая поверхностные особенности эктоцервикса, эндоцервикса и TZ, которые помогают в рассечении ткани. Эктоцервикс легко идентифицировать, поскольку поверхность гладкая, белая и блестящая, без слизи. Поверхность эндоцервикса шероховатая, красного цвета, покрыта слизью.TZ содержит наботианские кисты (опухшие железы из-за закупорки протоков плоской метаплазией). Эти большие кисты легко видны и являются диагностическими для TZ. D. Фотография типичного образца шейки матки, показывающая каждую область.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g001

Материалы и методы

Клеточная культура

Образцы ткани шейки матки человека были приобретены в Co-operative Human Tissue Network и отправлены на ночь на влажном льду.На тканях не было идентификации пациента, и все образцы изначально были получены для других целей. Таким образом, наши эксперименты были освобождены от одобрения Институциональным наблюдательным советом исследований на людях Кларксонского университета. Эпителиальные клетки человека выделяли из свежей ткани, как описано ранее [13], с использованием диспазы для отделения эпителия от дермы и трипсина для переваривания агрегатов клеток в небольшие кластеры клеток и отдельные клетки. Культуры клеток поддерживали в бессывороточной среде для кератиноцитов (KSFM, GIBCO), содержащей антибиотики.В некоторых экспериментах клетки TZ и эндоцервикса культивировали в среде EpiLife (GIBCO). В выбранных экспериментах первичные цервикальные культуры проверяли на наличие ДНК HPV16 с использованием праймеров E6 и E7. Никаких доказательств инфекции ВПЧ не было обнаружено, и ни в одном эксперименте по трансфекции не происходило спонтанной иммортализации. Первичные или вторичные культуры использовали для анализов иммортализации. Клеточные линии-продуценты ретровируса поддерживали в минимальной необходимой среде Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) плюс антибиотики.Стромальные клетки человека выделяли путем переваривания коллагеназой стромальной ткани шейки матки и культивировали в среде DMEM с 10% FBS. Совместное культивирование стромальных и цервикальных эпителиальных клеток проводили, как описано [14].

Эффективность трансфекции

Клетки шейки матки трансфицировали ДНК репортерного гена β-галактозидазы с использованием реагента липофектамин 3000 (Invitrogen). Через 24 ч трансфицированные клетки окрашивали в синий цвет с помощью набора для окрашивания β-gal (Invitrogen). Эффективность трансфекции рассчитывали путем деления количества окрашенных клеток на общее количество клеток.

Анализы иммортализации

Для полных геномных анализов HPV16 и HPV18 вторичные культуры цервикальных клеток трансфицировали плазмидной ДНК pMHPV16d или pSHPV18m [15] с использованием реагента липофектамин 3000. Через 24 часа клетки отбирали в 100 мкг / мл G418 в течение 2 дней. Трансфицировали три чашки 60 мм с клетками из каждой области шейки матки и подсчитывали количество чашек с бессмертными колониями после того, как культуры отрицательного контроля (только ген неомицина) стали стареющими.Плазмидную ДНК вируса обезьяны 40 (SV40) pBRWT2 [16], содержащую полный геном SV40, использовали в качестве положительного контроля для иммортализации. Всего эксперименты по трансфекции были выполнены на клетках шейки матки, выделенных от 24 разных пациентов (таблица S1). Для анализов иммортализации ретровирусов культуры клеток инфицировали ретровирусами HPV16 E6 / E7 [17], как описано [18], и отбирали в среде с 400 мкг / мл G418 в течение 2 дней. Всего эксперименты с ретровирусами были выполнены на клетках шейки матки, выделенных от восьми разных пациентов (таблица S2).Одинаковые запасы ретровируса использовали для всех трансфекций из одного и того же набора тканей шейки матки пациента. Для анализов совместного культивирования мы культивировали обработанные митомицином С (MMC) стромальные клетки шейки матки человека с первичными эпителиальными клетками шейки матки. Эпителиальные клетки трансфицировали плазмидой pMHPV16d, содержащей полный геном HPV16, с использованием тех же методов, которые описаны в анализе иммортализации, проведенном в KSFM, за исключением того, что совместные культуры поддерживали в рафтовой среде F12 / DMEM, содержащей 10% FBS [19]. Для анализов совместного культивирования стромальные клетки сначала культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS.Стромальные клетки обрабатывали 10 мкг / мл MMC в течение трех часов, затем дважды промывали свежей средой. Стромальные клетки, обработанные MMC, поддерживали еще два дня, чтобы убедиться, что они находятся в покое, но жизнеспособны. Клетки, обработанные MMC, использовали при 80% слиянии, чтобы позволить эпителиальным клеткам прикрепиться в пустых пространствах. Перед совместным культивированием эпителиальные клетки трансфицировали плазмидой pMHPV16d, содержащей полный геном HPV16. После трансфекции G418 трансфицированные эпителиальные клетки высевали в чашки со стромальными клетками и кормили рафтовой средой F12 / DMEM, содержащей 5% FBS.Эпителиальные клетки росли небольшими колониями между стромальными клетками. Когда диаметр колоний достигал 1-2 см, эпителиальные клетки пересевали в новую чашку для стромальных клеток, обработанных MMC. Анализы иммортализации совместного культивирования проводили в течение восьми недель, чтобы судить, были ли иммортализованы клетки. Всего эксперименты по трансфекции с использованием совместных культур были выполнены на клетках пяти разных пациентов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки культивировали на четырехлуночных предметных стеклах TEK (Fisher) и фиксировали в течение 10 мин, используя свежеприготовленный 4% -ный формалин с нейтральным буфером.Первичные кроличьи моноклональные антитела к кератину 14 (K14, ab51054, Abcam) и мышиные моноклональные антитела к K18 (ab7797, Abcam) использовали для двойного окрашивания. Для визуализации использовали вторичные ослиные антитела против мышиных (ab150105, Abcam) с тегом Alexa 488 и вторичные козьи антитела против кроликов (ab150080, Abcam) с тегами Alexa 594. Отрицательный контроль состоял из нерелевантных первичных антител, включая кроличий моноклональный изотипический контроль (ab172730, Abcam) и мышиный моноклональный изотипический контроль (ab170190, Abcam).Для однократного окрашивания использовали первичные мышиные моноклональные антитела к K17 (ab188859, Abcam), мышиные моноклональные антитела к MMP7 (sc-515703, Santa Cruz) и кроличьи моноклональные антитела к p63 (# 13109S, Cell Signaling). Коэффициент разбавления для всех первичных антител составлял 1: 300, а коэффициент разбавления для всех вторичных антител составлял 1: 500. Коэффициент усиления и время экспозиции флуоресцентного микроскопа были отрегулированы так, чтобы показать положительно окрашенные клетки, в то время как отрицательные контрольные клетки не имели окрашивания. Процент окрашивания рассчитывали делением количества положительно окрашенных клеток на общее количество клеток.Интенсивность окрашивания измеряли с помощью ImageJ, и отрицательный контроль использовали для вычитания фона.

Характеристика клеточных линий

Каждая из 24 клеточных линий, полученных нами, была протестирована коммерческой службой профилирования коротких тандемных повторов (STR) Американской коллекции типовых культур. Экспрессию РНК Е6 и Е7 HPV16 оценивали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров (прямой 5′-GACCCAGAAAGTTACCACAG-3 ‘HPV16 и обратный 5′-GCAACAAGACATACATCGAC-3′; HPV16 E7 прямой 5′-ATAGGAC и обратный 5’-TCATAGTGTGCCCATTAACAG-3 ‘).Устойчивость к терминальной дифференцировке каждой клеточной линии определяли путем посева клеток с клональной плотностью (50 клеток / лунка 6-луночного планшета) и оценки роста KSFM, в котором отсутствовали эпидермальный фактор роста и экстракт бычьего гипофиза и который был дополнен 1,4 мМ хлорида кальция. .

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и теста множественного сравнения Тьюки для попарных сравнений с программным обеспечением IBM SPSS версии 24.Расчет двустороннего значения p менее 0,05 считался значимым отличием.

Результаты

Характеристика культивируемых клеток и подтверждение происхождения

Мы описали процедуры выделения, культивирования и характеристики эпителиальных клеток человека из эктоцервикса, эндоцервикса и TZ [13,15]. Клетки из каждой области можно культивировать в течение 2–4 пассажей до старения, и каждый демонстрирует отличную морфологию при хранении в бессывороточной среде для кератиноцитов (KSFM) в монослойной культуре (рис. 2А).Культуры, полученные из эндоцервикса, неоднородны. Некоторые клетки пролиферируют, тогда как другие содержат везикулы и подвергаются секреторной дифференцировке. Культуры эктоцервикса однородны и содержат мелкие эпителиальные клетки, которые подвижны и мигрируют по чашке. Культуры из ТЗ имеют уникальную морфологию и характер роста. Они различаются по форме и растут как колонии, содержащие неподвижные, тесно связанные клетки. Стромальные клетки имели фибробластическую и удлиненную форму, отличавшуюся от эпителиальных клеток.

Рис. 2. Морфология клеток и экспрессия кератина однослойных культур клеток шейки матки.

A. Фазово-контрастная микроскопия первичных клеток шейки матки человека из каждой области, показывающая различную морфологию клеток. B. Иммуноокрашивание K14 и K18, демонстрирующее различную экспрессию в культуре клеток in vitro . C. Иммуноокрашивание K17 и MMP7 клеток, культивируемых из каждой области шейки матки. Нерелевантные первичные антитела использовали в качестве отрицательного контроля для иммуноокрашивания.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0199761.g002

Различные области эпителия шейки матки демонстрируют характерные паттерны экспрессии гена кератина in vivo [20]. Эктоцервикс экспрессирует K14, но не K18, эндоцервикс производит K18, но не K14, а TZ экспрессирует оба кератина. Предполагаемые стволовые клетки эпителия шейки матки (резервные клетки) содержат K17 и белок p63, связанный с трансформацией [20]. Сообщается, что матриксная металлопротеиназа 7 (MMP7) является маркером дискретной популяции клеток в плоскоколонном соединении, что способствует развитию рака шейки матки [21].Чтобы подтвердить происхождение наших эпителиальных культур, свежевыделенные клетки из каждой области шейки матки окрашивали на K14 и K18 (рис. 2B) или K17 или MMP7 (рис. 2C) с помощью иммунофлуоресценции.

Мы подсчитали процент эпителиальных клеток, которые положительно окрашивались для каждого маркера кератина (рис. 3). Более 90% эпителиальных клеток, культивируемых из эктоцервикса, экспрессировали K14, но не K18, тогда как более 90% эндоцервикальных клеток продуцировали K18, но не K14. Большинство эпителиальных клеток из TZ экспрессировали либо K14, либо K18, но небольшой процент продуцировал оба кератина (около 10%).Небольшой процент клеток, культивируемых из эндоцервикса и TZ, экспрессировал два маркера стволовых клеток, K17 и p63, но клетки из эктоцервикса не продуцировали K17. Мы наблюдали экспрессию MMP7 в небольшом проценте клеток из каждой шейной области, но этот маркер не был специфичным для клеток, культивируемых из TZ. В целом, эпителиальные клетки шейки матки, выделенные из каждой шейной области, сохранили свои характерные кератиновые маркеры, подтверждая, что они происходили из соответствующих эктоцервикальных, TZ и эндоцервикальных областей.

Рис. 3. Количественный анализ экспрессии клеточных маркеров эпителиальными клетками каждой шейной области.

Свежевыделенные клетки из каждой шейной области окрашивали антителами против K14, K18, K17, p63 или MMP7. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех экспериментов с использованием образцов от разных доноров. Звездочки указывают на статистические различия [** P <0,01; *** P <0,001].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g003

Иммортализация клеток TZ, эктоцервикса или эндоцервикса

Основная цель этой работы состояла в том, чтобы сравнить восприимчивость эпителиальных клеток, культивируемых из каждой области шейки матки, к иммортализации ВПЧ16, наиболее часто встречающимся типом ВПЧ высокого риска.Мы исследовали три различных метода иммортализации. Первые два были выполнены в бессывороточной среде для кератиноцитов (KSFM) и состояли из (1) трансфекции полным геномом HPV16 или HPV18 или (2) инфицирования ретровирусами с высоким титром, кодирующими онкогены HPV16 E6 и E7. Мы также исследовали иммортализацию в третьем анализе, который включал совместное культивирование клеток, трансфицированных ВПЧ16, с клетками стромы шейки матки в среде, содержащей сыворотку [14].

Иммортализация полным геномом ВПЧ16

Вторичные культуры клеток из каждой шейной области поддерживали в KSFM и трансфицировали плазмидой pMHPV16d [15], которая содержит две копии полного генома HPV16 плюс ген устойчивости к неомицину.Клетки, трансфицированные только геном устойчивости к неомицину, служили отрицательным контролем, а клетки, трансфицированные ДНК SV40, служили положительным контролем для иммортализации. Мы исследовали 24 ткани шейки матки от разных пациентов, и для каждого пациента мы трансфицировали чашки для культивирования 3 x 60 мм из каждой области шейки матки ДНК HPV16 (таблица S1). Мы кратко отбирали культуры в KSFM, содержащие G418, чтобы убить нетрансфицированные клетки, а затем субкультивировали клетки до тех пор, пока отрицательные контроли (только neo) не стали стареющими.Клетки, трансфицированные HPV16, которые избежали старения, можно многократно субкультивировать для получения линий иммортализованных HPV16 клеток (описанных ниже).

Одна потенциальная проблема заключалась в том, что клетки, культивируемые из каждой области, различались по чувствительности к трансфекции (рис. 4A). Эктоцервикальные клетки трансфицировались легче всего, тогда как эндоцервикальные клетки трансфицировать было трудно. Поскольку различия в эффективности трансфекции могут влиять на эффективность иммортализации, мы нормализовали каждый эксперимент по иммортализации на эффективность трансфекции с использованием реплицированных культур, которые были трансфицированы репортерным геном β-галактозидазы.Когда данные были нормализованы для контроля эффективности трансфекции, мы обнаружили, что эктоцервикальные клетки иммортализовались немного чаще, чем TZ или эндоцервикальные клетки (рис. 4B). В анализах иммортализации с использованием HPV18 мы не наблюдали значительных различий между клетками шейки матки из каждой области (рис. 4C). В эктоцервикальных культурах, когда иммортализация не происходила, клетки становились стареющими, и их морфология напоминала нетрансфицированные отрицательные контроли. Напротив, некоторые TZ и большинство эндоцервикальных культур пережили период кризиса, когда многие клетки умерли, а меньшая субпопуляция выжила и стала бессмертной.Когда эксперименты проводились с использованием культур, прикрепленных к покрытым коллагеном чашкам, мы наблюдали меньшую вариабельность между эффективностью иммортализации клеток эктоцервикса, эндоцервикса и TZ (рис. 4D и таблица S2). Чтобы определить, были ли различия в эффективности иммортализации специфичными для HPV16, мы выполнили анализы с использованием ДНК SV40 (другого небольшого ДНК-опухолевого вируса). Результаты показали, что ДНК SV40 вызвала иммортализацию эктоцервикальных клеток> клеток из TZ> клеток эндоцервикса (рис. 4B). Таким образом, клетки, культивируемые из TZ, не были более восприимчивы к иммортализации с полными геномами HPV16, HPV18 или SV40.

Рис. 4. Эффективность трансфекции и эффективность иммортализации после трансфекции ДНК HPV16, HPV18 или SV40.

A. Эффективность трансфекции репортерного гена бета-галактозидазы в клетках раннего пассажа эктоцервикса, TZ и эндоцервикса. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка 13 экспериментов с использованием образцов от разных доноров. Б. Эффективность иммортализации клеток шейки матки из каждой области после нормализации для различий в скорости трансфекции. В каждом эксперименте использовались отрицательные контроли, состоящие из культур, трансфицированных только геном неомицина, и все культуры отрицательного контроля становились стареющими после 2-3 пассажей.Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка экспериментов от 24 доноров (HPV16) или 12 доноров (SV40). C. Эффективность иммортализации клеток шейки матки с помощью HPV18 после нормализации различий в скорости трансфекции. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка экспериментов от пяти доноров (HPV18). D. Эффективность иммортализации клеток шейки матки с помощью HPV16, когда клетки поддерживались на покрытых коллагеном планшетах для культивирования клеток. Звездочки указывают на статистические различия [** P <0,01; *** P <0.001].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g004

Иммортализация ретровирусами, кодирующими HPV16

Мы провели иммортализацию с использованием ретровирусов с высоким титром, кодирующих гены HPV-16 E6 и E7 , а также ген устойчивости к неомицину [17]. Мы использовали ретровирусы, потому что они с высокой эффективностью инфицируют культивируемые клетки шейки матки [18]. Ретровирусы, содержащие только ген устойчивости к неомицину (без ВПЧ), служили отрицательным контролем для иммортализации.Мы инфицировали вторичные культуры из эктоцервикса, эндоцервикса или TZ неразбавленными супернатантами из клеточных линий-продуцентов и отбирали в G418 для уничтожения неинфицированных клеток. Культуры постоянно субкультивировали до тех пор, пока инфицированные neo-only вирусом не становились стареющими (от 2 до 4 пассажей). В предварительных экспериментах приблизительно 90% клеток были инфицированы неразбавленными запасами вируса, и эта инфекция высокого уровня привела к 100% иммортализации во всех экспериментах, независимо от области происхождения шейки матки (данные не показаны).Поэтому мы разбавили вирусные супернатанты 1: 4 и повторили эксперименты для измерения эффективности заражения (рис. 5A) и полученного иммортализации (рис. 5B и таблица S3). Разбавленные супернатанты ретровируса инфицировали от 15 до 20% клеток во всех культурах, а эктоцервикальные клетки инфицировали с максимальной эффективностью. После нормализации эффективности инфекции мы обнаружили, что клетки эктоцервикса были иммортализованы немного более эффективно, чем клетки из других регионов, хотя эти различия не были статистически значимыми (рис. 5B).Таким образом, клетки, культивируемые из TZ, не были более восприимчивы к иммортализации ретровирусами HPV16 E6 / E7.

Рис. 5. Заражение и иммортализация ретровирусами, кодирующими HPV16 E6 / E7 .

А. Эффективность заражения клеток эктоцервикса, ТЗ и эндоцервикса. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка восьми экспериментов с использованием образцов от разных доноров. Б. Эффективность иммортализации клеток шейки матки из каждой области, которая была нормализована для различий в частоте инфицирования.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка восьми экспериментов с использованием образцов от разных доноров. Звездочки показывают статистические различия [** P <0,01; *** P <0,001].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g005

Иммортализация в совместных культурах стромальных клеток

Кератиноциты можно совместно культивировать со стромальными клетками в среде, содержащей сыворотку [14], и совместно культивируемые кератиноциты ведут себя иначе в анализах иммортализации, чем культуры, поддерживаемые в бессывороточной среде [22].Поэтому мы исследовали эффективность иммортализации полным геномом HPV16 с использованием совместных культур первичных стромальных клеток человека и эпителиальных клеток эктоцервикса, эндоцервикса и TZ (рис. 6 и таблица S4). Мы наблюдали, что эффективность иммортализации для каждого типа эпителиальных клеток в совместной культуре была аналогична эффективности, наблюдаемой в KSFM. Таким образом, наши результаты трех различных анализов иммортализации (полный геном HPV16, ретровирусы HPV16 E6 / E7 или полный геном плюс совместное культивирование) показали, что клетки TZ шейки матки не были иммортализованы более эффективно, чем клетки эктоцервикса или эндоцервикса.

Рис. 6. Иммортализация путем трансфекции полным геномом HPV16 с использованием совместных культур эпителиальных и стромальных клеток.

A. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка пяти экспериментов с использованием образцов от разных доноров. При использовании ANOVA и апостериорного критерия Тьюки (SPSS) значимых различий не наблюдалось, p> 0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g006

Разработка иммортализованных клеточных линий HPV16 из TZ, эктоцервикса и эндоцервикса

иммортализованных HPV16 клеток из эктоцервикса, эндоцервикса и TZ непрерывно росли в культуре, и были получены стабильные клеточные линии (Таблица 1).Мы пропустили все эти клеточные линии по крайней мере 50 раз, и ни одна из них не показала признаков замедления роста или старения. Мы установили совпадающие клеточные линии эктоцервикса, эндоцервикса и TZ от восьми разных пациентов (24 отдельные клеточные линии). Происхождение каждой клеточной линии было подтверждено профилированием коротких тандемно-повторяющихся последовательностей (STR), выполненным Американской коллекцией типовых культур (таблица S5). Результаты STR показали, что эктоцервикальные, TZ и эндоцервикальные клеточные линии от каждого пациента имели одинаковый STR-паттерн, подтверждая их общее происхождение.Результаты STR также показали, что каждая из этих 24 новых линий клеток отличалась по профилю STR от всех других установленных линий клеток ATCC (т.е. не было загрязнения другими существующими линиями клеток). В таблице 1 показаны некоторые свойства 12 этих новых клеточных линий от четырех разных пациентов. Иммортализованные клеточные линии HPV16, полученные из эндоцервикальных клеток, обычно переживали период кризиса, когда большинство клеток погибало до того, как небольшая субпопуляция становилась бессмертной. Таким образом, было сложнее установить клеточные линии из эндоцервикса.Большинство бессмертных клеточных линий напоминали первичные клетки, из которых они были получены, в отношении экспрессии кератина. Линии эндоцервикальных клеток экспрессировали высокие уровни K18, но никогда не экспрессировали K14 (фиг. 7). Напротив, эктоцервикальные и TZ-клеточные линии экспрессировали большое количество K14, но низкие уровни K18. Одной интересной особенностью клеточных линий, полученных из TZ, была их устойчивость к терминальной дифференцировке в ответ на удаление факторов роста (EGF и экстракт бычьего гипофиза) плюс добавление 1,4 мМ кальция в культуральную среду.Будет важно более полно охарактеризовать дифференцировку иммортализованных линий шейки матки HPV16 либо in vivo, , либо в органотипических культурах. Эти недавно созданные клеточные линии, иммортализованные ВПЧ16, представляют собой уникальный инструмент для изучения клеток TZ, эктоцервикса и эндоцервикса и сравнения их реакции на факторы, способствующие канцерогенезу шейки матки.

Рис. 7. Экспрессия кератина в клеточных линиях, иммортализованных ВПЧ.

A. Иммунофлуоресцентное окрашивание на K14 и K18 в иммортализованных клеточных линиях CX16-RV2, полученных из TZ, эктоцервикса и эндоцервикса.B. Количественный анализ интенсивности окрашивания K14 и K18 в 12 иммортализованных линиях шейки матки HPV16. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка четырех экспериментов с использованием образцов от разных доноров. Звездочки показывают статистические различия [*** P <0,001].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.g007

Обсуждение

Рак шейки матки является серьезной проблемой общественного здравоохранения, и важным фактором риска этого заболевания является стойкая инфекция, вызываемая типами ВПЧ высокого риска, такими как ВПЧ16 [2].Большинство инфекций, вызванных ВПЧ высокого риска, не прогрессируют до рака, и неясно, почему только небольшая подгруппа претерпевает злокачественную конверсию. Важным наблюдением является то, что более 90% рака шейки матки развивается в узкой области ЗТ шейки матки, даже если ВПЧ поражает клетки по всей шейке матки [8]. Мы предположили, что человеческие эпителиальные клетки, культивируемые из TZ, могут быть более восприимчивыми к клеточной иммортализации, ранней стадии развития рака. Мы использовали три различных анализа иммортализации HPV16 для сравнения клеток эктоцервикса, эндоцервикса и TZ.В отличие от нашей гипотезы, клетки TZ были столь же восприимчивы к иммортализации, как и клетки из других регионов. Таким образом, наша работа предполагает, что другие характеристики TZ способствуют повышенной восприимчивости к канцерогенезу шейки матки. Мы разработали 24 иммортализованные клеточные линии HPV16, полученные из TZ, эктоцервикса и эндоцервикса 8 различных пациентов. Эти клеточные линии будут полезны для исследования свойств клеток TZ, которые делают их восприимчивыми к злокачественному развитию.

Мы подтвердили, что клетки, используемые в анализах иммортализации, действительно происходили из соответствующих областей ткани шейки матки.Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что культуры, полученные из TZ, эктоцервикса или эндоцервикса, экспрессировали тот же образец K14 и K18, который наблюдали in vivo . Кроме того, клетки, культивируемые из TZ и эндоцервикса, экспрессировали K17 и p63, маркеры резервных клеток, которые являются предполагаемыми предшественниками рака шейки матки [20]. Недавние исследования описали дискретную популяцию клеток плоскостолбикового соединения (SC), которые, по-видимому, являются предшественниками рака шейки матки [21]. Чтобы определить, включали ли наши тесты иммортализации эти SC-клетки, мы исследовали экспрессию MMP7, маркера SC-клеток in vivo [21].Мы наблюдали экспрессию MMP7 в небольшом проценте клеток, выделенных из TZ, но мы также обнаружили MMP7 в клетках, культивируемых из эктоцервикса и эндоцервикса. Предыдущая работа показала, что эпидермальный фактор роста (EGF), который присутствует в KSFM, может индуцировать экспрессию MMP7 [23]. Это могло бы объяснить наше наблюдение, что MMP7 экспрессируется в клетках из всех регионов. Из-за влияния выделения и роста клеток в культуре может быть трудно связать экспрессию специфических маркеров плоскоколонных соединений in vitro с их паттерном экспрессии в шейке матки.Поскольку клетки SC представляют собой относительно небольшую и дискретную популяцию клеток, возможно, что только некоторые из этих клеток присутствовали в культурах, полученных из TZ.

Одна из потенциальных проблем заключалась в том, что клетки TZ и эндоцервикса трудно трансфицировать. Мы контролировали это путем нормализации эффективности иммортализации (деления на эффективность трансфекции) или с помощью ретровирусов с высоким титром для эффективной доставки генов E6 / E7 HPV16 во все клетки. Другой проблемой была значительная вариабельность эффективности иммортализации клеток, выделенных от разных пациентов (таблица S1).Поэтому мы выполнили анализ иммортализации с использованием большого количества тканей от нескольких пациентов, чтобы подтвердить воспроизводимость наших результатов. Интересным наблюдением было то, что клетки эндоцервикса, трансдуцированные ВПЧ16 (трансфецированные или инфицированные), обычно подвергались кризу, и большинство клеток погибали или становились стареющими (Таблица 1). Таким образом, было трудно получить иммортализованные клеточные линии HPV-16 из эндоцервикса.

Наши результаты ясно показали, что клетки, культивируемые из цервикальной TZ, не были более восприимчивы к иммортализации HPV16.Таким образом, другие характеристики TZ могут способствовать повышенной предрасположенности к злокачественному развитию. Зоны трансформации существуют в эпителиальных тканях по всему телу, и многие из них являются предпочтительными участками для развития рака [11]. В канцерогенезе шейки матки важное значение могут иметь несколько характеристик ТЗ [24]. Сообщалось, что клетки из TZ более восприимчивы к инфекции HPV [25,26], возможно, из-за снижения иммунного ответа в этой области [9]. Другие сообщили о повышенных уровнях рецепторов эстрогена [10] или повышенной чувствительности к эстрогенам в TZ модели мышей [27].Таким образом, разумно, что несколько факторов способствуют повышенной чувствительности TZ к канцерогенезу, индуцированному ВПЧ.

Мы получили 24 иммортализованных клеточных линии HPV16, которые будут полезны для изучения различий между TZ, эктоцервиксом и эндоцервиксом. Эти совпадающие эктоцервикальные, эндоцервикальные и TZ-линии были получены от восьми разных пациентов. Мы проверили каждую клеточную линию с помощью ПЦР и подтвердили, что каждая экспрессирует РНК Е6 и Е7 HPV16 (данные не показаны). Эти новые клеточные линии были уникальными с точки зрения STR-анализа, поскольку они не соответствовали каким-либо ранее известным линиям из ATCC (таблица S5).У семи из восьми пациентов эндоцервикальная, эктоцервикальная и TZ-линии имели идентичные STR-профили, как и ожидалось. Однако линия эндоцервикальных клеток CX16-RV3 потеряла два маркера на одной хромосоме по сравнению с эктоцервикальными аналогами и аналогами TZ. Это может быть связано с продолжительным периодом кризиса, который возникает при иммортализации эндоцервикальных клеток (Таблица 1). Все линии эндоцервикальных клеток, иммортализованные HPV16, напоминали первичные культуры клеток эндоцервикса, поскольку они экспрессировали K18, но не экспрессировали K14. Иммортализованные клеточные линии эктоцервикса и TZ напоминали первичные культуры, поскольку они экспрессировали высокие уровни K14.Однако некоторые линии эктоцервикальных и TZ-клеток также экспрессировали низкие уровни K18, в отличие от их аналогов в первичной культуре.

Это согласуется с предыдущей работой, которая показала, что иммортализация клеток вызывает экспрессию K18 в эктоцервикальных клетках [15].

В целом, мы показали, что эпителиальные клетки из TZ не обладают большей восприимчивостью к иммортализации HPV16, чем клетки из эктоцервикса или эндоцервикса. Таким образом, другие свойства TZ, вероятно, объясняют усиление злокачественного прогрессирования.Другим важным результатом была разработка иммортализованных клеточных линий HPV16 из TZ, эктоцервикса и эндоцервикса. Эти линии могут помочь изучить свойства клеток, которые способствуют злокачественному развитию.

Основные выводы

1. Эпителиальные клетки, культивируемые из TZ человека, были не более восприимчивы к иммортализации HPV16, чем клетки из эктоцервикса или эндоцервикса
2. Соответствующие клеточные линии эктоцервикса, эндоцервикса и TZ были получены от 8 разных пациентов (24 отдельные клеточные линии) и подтверждены профилированием STR

Вспомогательная информация

S5 Таблица.Профилирование коротких тандемных повторов (STR) иммортализованных ВПЧ клеточных линий шейки матки.

Как и ожидалось, профиль STR отличался в клеточных линиях, полученных от разных пациентов. Напротив, профиль STR был идентичным у экто-, эндо- и TZ-производных клеточных линий от всех пациентов, кроме одного (данные не показаны). В CX16-RV3 линия эндоцервикального происхождения потеряла маркеры TH01 и D13S317 на одной хромосоме.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199761.s005

(TIF)

Благодарности

Нормальные образцы шейки матки человека были приобретены в Cooperative Human Tissue Network (CHTN).Мы благодарим Брайена О’Киф за предоставление иллюстраций для рис. 1.

Ссылки

1. 1. Ферлей Дж., Сурджоматарам И., Дикшит Р., Эсер С., Мазерс С., Ребело М. и др. Заболеваемость и смертность от рака во всем мире: источники, методы и основные закономерности в GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015; 136: E359–386. pmid: 25220842
2. 2. Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, Rodriguez AC, Wacholder S. Вирус папилломы человека и рак шейки матки. Ланцет. 2007; 370: 890–907. pmid: 17826171
3. 3.de Sanjose S, Quint WG, Alemany L, Geraets DT, Klaustermeier JE, Lloveras B и др. Атрибуция генотипа вируса папилломы человека при инвазивном раке шейки матки: ретроспективное перекрестное всемирное исследование. Ланцет Онкол. 2010; 11: 1048–1056. pmid: 20952254
4. 4. Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM, Schlegel R. Гены E6 и E7 вируса папилломы человека типа 16 вместе необходимы и достаточны для трансформации первичных кератиноцитов человека. J Virol. 1989; 63: 4417–4421.pmid: 2476573
5. 5. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. Признаки рака. Клетка. 2000; 100: 57–70. pmid: 10647931
6. 6. Koshiol JE, Schroeder JC, Jamieson DJ, Marshall SW, Duerr A, Heilig CM, et al. Время до выведения вируса папилломы человека по типу и серостатус вируса иммунодефицита человека. Int J Cancer. 2006; 119: 1623–1629. pmid: 16646070
7. 7. Castle PE, Родригес А.С., Поррас С., Эрреро Р., Шиффман М., Гонсалес П. и др. Сравнение вируса папилломы человека шейки матки и влагалища.Sex Transm Dis. 2007; 34: 849–855. pmid: 17621246
8. 8. Бургхардт Э., Остор АГ. Локализация и происхождение плоскоклеточного рака шейки матки: гистоморфологическое исследование. Obstet Gynecol. 1983; 62: 117–127. pmid: 6856213
9. 9. Джаннини С.Л., Хуберт П., Дойен Дж., Бонивер Дж., Делвенн П. Влияние микросреды эпителия слизистой оболочки на клетки Лангерганса: последствия для развития плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки. Int J Cancer. 2002; 97: 654–659. pmid: 11807793
10. 10.Ремуэ Ф, Якобс Н., Миот В., Бонивер Дж., Делвенн П. Высокая интраэпителиальная экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в зоне трансформации шейки матки. Am J Obstet Gynecol. 2003. 189: 1660–1665. pmid: 14710094
11. 11. McNairn AJ, Guasch G. Эпителиальные переходные зоны: слияние микросреды, ниши и клеточная трансформация. Eur J Dermatol. 2011; 21 Дополнение 2: 21–28.
12. 12. Martens JE, Smedts FM, Ploeger D, Helmerhorst TJ, Ramaekers FC, Arends JW, et al.Картина распределения и профиль маркера показывают две субпопуляции резервных клеток в эндоцервикальном канале. Int J Gynecol Pathol. 2009. 28: 381–388. pmid: 19483623
13. 13. Vandermark ER, Deluca KA, Gardner CR, Marker DF, Schreiner CN, Strickland DA, et al. Белки E6 и E7 вируса папилломы человека типа 16 изменяют NF-kB в культивируемых эпителиальных клетках шейки матки, а ингибирование NF-kB способствует росту и иммортализации клеток. Вирусология. 2012; 425: 53–60. pmid: 22284893
14. 14.Райнвальд Дж. Г., Грин Х. Серийное культивирование штаммов эпидермальных кератиноцитов человека: образование ороговевших колоний из отдельных клеток. Клетка. 1975. 6: 331–343. pmid: 1052771
15. 15. Вудворт С.Д., Боуден П.Е., Донигер Дж., Пириси Л., Барнс В., Ланкастер В.Д. и др. Характеристика нормальных клеток экзоцервикального эпителия человека, иммортализованных in vitro ДНК папилломавирусов 16 и 18 типов. Cancer Res. 1988. 48: 4620–4628. pmid: 2456144
16. 16. Вудворт С., Секотт Т., Исом Х.С.Трансформация гепатоцитов крысы путем трансфекции ДНК обезьяньего вируса 40 с получением пролиферирующих дифференцированных клеток. Cancer Res. 1986; 46: 4018–4026. pmid: 3015381
17. 17. Халберт К.Л., Демерс Г.В., Галлоуэй Д.А. Гена E7 вируса папилломы человека типа 16 достаточно для иммортализации эпителиальных клеток человека. J Virol. 1991; 65: 473–478. pmid: 1845902
18. 18. Вудворт С.Д., Ченг С., Симпсон С., Хамахер Л., Чоу Л.Т., Брокер Т.Р. и др. Рекомбинантные ретровирусы, кодирующие гены E6 и E7 вируса папилломы человека 18 типа, стимулируют пролиферацию и задерживают дифференцировку кератиноцитов человека сразу после заражения.Онкоген. 1992; 7: 619–626. pmid: 1314365
19. 19. Вудворт С.Д., Майкл Э., Маркер D, Аллен С., Смит Л., Нис М. Ингибирование рецептора эпидермального фактора роста увеличивает экспрессию генов, которые стимулируют воспаление, апоптоз и прикрепление клеток. Mol Cancer Ther. 2005. 4: 650–658. pmid: 15827339
20. 20. Martens JE, Arends J, Van der Linden PJQ, De Boer BAG, Helmerhorst TJM. Цитокератин 17 и p63 являются маркерами клетки-мишени HPV, цервикальной стволовой клетки.Anticancer Res. 2004. 24: 771–775. pmid: 15161025
21. 21. Херфс М., Ямамото Ю., Лори А., Ван Х, Нуччи М.Р., Маклафлин-Друбин М.Э. и др. Дискретная популяция клеток плоскоклеточного соединения, участвующих в патогенезе рака шейки матки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012; 109: 10516–10521. pmid: 22689991
22. 22. Чепмен С., Лю X, Мейерс С., Шлегель Р., Макбрайд А.А. Кератиноциты человека эффективно иммортализуются ингибитором киназы Rho. J Clin Invest. 2010; 120: 2619–2626.pmid: 20516646
23. 23. Cury PR, de Araújo VC, Canavez F, Furuse C, Leite KRM, de Araújo NS. Влияние эпидермального фактора роста на матриксные металлопротеиназы и тканевые ингибиторы экспрессии гена металлопротеиназы в культивируемых фибробластах десен человека. Arch Oral Biol. 2007. 52: 585–590. pmid: 17181997
24. 24. Херфс М., Сунг Т.Р., Делвенн П., Крам С.П. Расшифровка многофакторной восприимчивости клеток слизистой оболочки к инфекции ВПЧ и связанного с ней канцерогенеза.Вирусы. 2017; 9: 85
25. 25. Castle PE, Jeronimo J, Schiffman M, Herrero R, Rodríguez AC, Bratti MC и др. Возрастные изменения шейки матки влияют на распространение вируса папилломы человека по типу. Cancer Res. 2006; 66: 1218–1224. pmid: 16424061
26. 26. Hwang LY, Ma Y, Shiboski SC, Farhat S, Jonte J, Moscicki AB. Активная плоскоклеточная метаплазия эпителия шейки матки связана с последующим заражением вирусом папилломы человека 16 среди здоровых молодых женщин.J Infect Dis. 2012; 206: 504–511. pmid: 22696500
27. 27. Элсон Д.А., Райли Р.Р., Лейси А., Тордарсон Дж., Таламантес Ф.Дж., Арбейт Дж. М.. Чувствительность зоны трансформации шейки матки к эстроген-индуцированному плоскоклеточному канцерогенезу. Cancer Res. 2000; 60: 1267–1275. pmid: 10728686

Рост и характеристика эпителиальных клеток нормальной эктоцервикса и эндоцервикса матки человека на JSTOR

Шейка матки человека состоит из эндоцервикального канала, выстланного одним слоем столбчатых слизистых клеток, и наружной эктоцервикса, покрытой многослойным плоским эпителием.Мы сообщаем здесь культуру эндоцервикальных эпителиальных клеток человека (HEnE) и эктоцервикальных эпителиальных клеток человека (HEcE) в бессывороточной среде (KGM). Культуры как HEnE, так и HEcE состоят из кератиноцитоподобных клеток, которые образуют десмосомные контакты и расслаиваются в присутствии высоких концентраций ионов кальция. Клетки с морфологией плеоморфного эпителия наблюдались в культурах HEnE, но не в культурах HEcE. Кератин 18, который характерен для эндоцервикса in vivo, был обнаружен путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания во всех клетках HEnE, но никогда не обнаруживался в культивируемых HEcE.HEcE экспрессировал кератин 13, который характерен для эктоцервикса in vivo. Хотя кератин 13 никогда не обнаруживался в первичных культурах HEnE, он экспрессировался в пассированных культурах HEnE, выращенных в среде с высокими концентрациями кальция, и в культурах позднего пассажа HEnE. HEnE претерпел в среднем 15,1 удвоения популяции во время серийного культивирования. Средняя эффективность образования колоний во время пассажей 2–3 составила 14,7%, а среднее время удвоения популяции — 17,8 часа. Культуры HEcE претерпели значительно большее удвоение популяции (29.0), чем культуры HEnE, тогда как эффективность образования колоний и время удвоения были аналогичны тем, которые были определены для HEnE. Клетки HEnE и HEcE могут быть полезны при разработке моделей плоской метаплазии шейки матки in vitro и для изучения взаимодействий между дифференцировкой клеток-мишеней, канцерогенами и папилломавирусами в развитии неоплазии шейки матки.

Общество биологии in vitro (SIVB) было основано в 1946 году как Ассоциация культур тканей для содействия обмену знаниями о биологии in vitro клеток, тканей и органов как растений, так и животных (включая человека).Основное внимание уделяется биологическим исследованиям, разработкам и приложениям, имеющим значение для науки и общества. Миссия осуществляется через публикации Общества; национальные и местные конференции, встречи и семинары; и через поддержку учебных инициатив в сотрудничестве с образовательными учреждениями. С годами SIVB расширился, чтобы создать среду для научного обмена и междисциплинарного взаимодействия с целью развития существующих и будущих систем для биологии in vitro.

Чувствительность зоны трансформации шейки матки к эстроген-индуцированному плоскоклеточному канцерогенезу

Abstract

Области, где один тип эпителия замещает другой (метаплазия), имеют склонность к образованию рака. Факторы окружающей среды внимательно связано с метапластическим канцерогенезом. В частности, рак шейки матки ассоциированные с инфекцией, вызванной вирусом папилломы человека (ВПЧ), развиваются в первую очередь в зоне трансформации, области, где метапластические плоские клетки выявляются в эндоцервикальных каналах, выстланных столбчатым эпителием. железы.Ранее мы сообщали, что эстроген-индуцированный многоэтапный вагинальный и канцерогенез шейки матки у трансгенных мышей, экспрессирующих онкогены HPV16 в базальных клетках плоского эпителия. В настоящем исследовании для изучения пороговый неопластический ответ на экзогенный эстроген, мы лечили группы трансгенных мышей с более низкими дозами гормонов. 5-кратное снижение в дозе эстрогена индуцировал плоскоклеточный канцерогенез только в шейном отделе зона трансформации по сравнению с другими репродуктивными путями места. Дальнейшее изучение очерченных этапов трансформации зоны канцерогенез, включая образование гиперпластической нижней части матки железы и появление множественных очагов плоской метаплазии из отдельные стволовые железистые резервные клетки, за которыми следуют неопластические прогрессирование метаплазии в дисплазию и плоскоклеточный рак.Мы предлагаем что сочетание низких доз эстрогена и низкоуровневого онкогена ВПЧ экспрессия смещает зону трансформации железистых резервных клеток в сторону решения судьбы плоскоклеточного, а не столбчатого эпителия. Синергетический активация пролиферации вирусным онкобелковым клеточным циклом нарушение регуляции и передачи сигналов рецептора эстрогена, вместе с измененные паракринные стромально-эпителиальные взаимодействия, могут способствовать поддерживают и способствуют опухолевому прогрессированию и образованию рака.

ВВЕДЕНИЕ

Эпителиальный канцерогенез часто возникает в результате метаплазии, процесс, в котором определенный тип ячейки, обычно находящийся в другая ткань или орган, находится в другой ткани (1) .Общие черты метаплазии включают изменения судьбы стволовых клеток. решения и ремоделирование эпителиально-стромальной ткани (2) . Метаплазия возникает во время развития и полового созревания, но ее внешний вид как адаптивный ответ на вредные раздражители окружающей среды по всей видимости, это первая стадия нескольких типов эпителиального рака. Примеры метапластического эпителиального канцерогенеза включают: ( a ) метаплазия столбчатых клеток (пищевод Барретта), хроническая гастроэзофагеальный кислотный рефлюкс и аденокарцинома пищевода (3) ; ( b ) желудочно-кишечная метаплазия, Инфекция Helicobacter pylori, и рак желудка (4 , 5) ; ( c ) многослойная плоскоклеточная метаплазия, хроническая курение и рак легких; и ( d ) плоскоклеточный железистый метаплазия, «высокий риск» ВПЧ 3 инфекция и рак шейки матки (6 , 7) .Несмотря на растущее понимание молекулярного контроля эпителиального канцерогенез в целом (8) , точные механизмы лежащая в основе индукция эпителиальной метаплазии или ее склонность к канцерогенез неясны.

Канцерогенез шейки матки, связанный с ВПЧ, в первую очередь влияет на метапластический плоский эпителий в определенном анатомическом месте, зона трансформации. Топография и естественная история этого региона сложный и динамичный, зависит от возраста, гормонального статуса, беременности, и паритет (1) .У взрослых женщин зона трансформации обычно находится на влагалищной поверхности шейки матки, неровная линия демаркация, отделяющая один тип эпителия от другого (1) . Под микроскопом столбчатый эпителий выстилает как эндоцервикальный канал и связанные с ним эндоцервикальные железы, тогда как плоскоклеточный эпителий покрывает внешнюю шейку матки. Во время плоскоклеточного шейного отдела метаплазии, среди эндоцервикальный железистый столбчатый эпителий (1) . ВПЧ оказывается тропическим для зоны трансформации шейки матки во время инфекции и хронические заболевания.Зона трансформации может иметь уникальный метаболизм эстрогенов по сравнению с другими репродуктивными путями типы эпителиальных клеток, продуцирующих метаболиты гормонов с прямым генотоксичность (9) .

Мы исследовали механизмы многоступенчатого плоскоклеточного рака, ассоциированного с ВПЧ. канцерогенез у трансгенных мышей K14-HPV16, содержащих весь HPV16 ранняя область, клонированная позади промотора кератина-14 человека и экспрессирующая вирусные онкогены в базальных клетках плоского эпителия (10, 11, 12, 13) . Плоскоклеточный рак, вызванный хроническим лечением эстрогенами раковые образования преимущественно во влагалище и наружной шейке трансгенных мышей (14) .В настоящем исследовании мы обнаружили, что 5-кратная снижение дозировки гормонов по сравнению с нашим первоначальным исследованием (14) , производимый многоступенчатый канцерогенез ограничен исключительно в зону трансформации шейки матки трансгенных мышей. Трансформация Зональный канцерогенез демонстрирует биологию, отличную от биологии нашего предыдущая модель. Мультифокальная плоская железистая метаплазия развивается при нижняя часть матки и метапластические очаги прогрессируют до дисплазии высокой степени и инвазивный рак. Увеличение популяции базальных плоскоклеточных клеток потенциально экспрессирующие как рецептор эстрогена-α, так и трансген ВПЧ может также лежать в основе синергизма между вирусными онкогенами и эстрогенами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разведение мышей, уход и гормональное лечение.

Гранулы непрерывного высвобождения для подкожного введения, которые доставляют 17β-эстрадиол в дозы 0,25, 0,10, 0,05 и 0,01 мг в течение 60 дней (инновационный Research of America, Сарасота, Флорида) были имплантированы в спинной части спины. кожа гетерозиготных 1-месячных трансгенных мышей K14-1203 # 1 (15) . Группы мышей лечили гормоном по 1, 3, 4, 5 и 6 месяцев. Те группы, которые лечились более 2 месяцев, имели две или три отдельные вставки гранул.Мышей размещали в барьерный объект, свободный от патогенов, и все процедуры были одобрены Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Комитет по исследованиям на животных.

Жертвоприношение, перфузия и рассечение животных.

Как описано ранее (13 , 15) , мыши получали i.p. инъекции BrdUrd 100 мг / кг и под анестезией авертином, были умерщвлены через 2 часа перфузией восходящей аорты 3,75% параформальдегида. Репродуктивные тракты и окружающие мягкие ткань, включая любые лимфатические узлы, были рассечены и закреплены в течение ночи при 4 ° C.Была удалена задняя стенка влагалища, и ткани были промыты в PBS, обезвожены с помощью градуированных спиртов и ксилол, ориентированный разрезом влагалищной поверхности вниз, залитый в парафине, срезы размером 5 мкм окрашивали H&E.

Кератиновая иммуногистохимия.

Окрашивание иммунопероксидазой для экспрессии кератина-14 проводили как описанный ранее (11 , 15) . Срезы инкубировали с кроличьим антимышиным антителом K14 (BAbCO), 1:10 000 в 3% BSA, в течение ночи при 4 ° C.Окрашивание иммунопероксидазой проводили с использованием 3,3′-диаминобензидин (каталожный номер D5637; Sigma), и секции контрастировали гематоксилином.

Синтез тканевой ДНК.

Иммуногистохимия для обнаружения включения BrdUrd была выполнена как описанный ранее (13 , 15) . Количество диаминобензидин-положительные ядра подсчитывали в пяти соседних × 20 поля в цервикальном канале и зоне трансформации.

Экспрессия рецептора эстрогена.

Парафиновые срезы плавили при 55 ° C в течение 20 мин, сразу депарафинизированные, регидратированные и кипяченные в микроволновой печи в течение 10 мин за 10 минут. мМ цитратный буфер (pH 6,0). После охлаждения в комнату температуры, срезы блокировали в 10% BSA, инкубировали в течение ночи при 4 ° C с антителом к ​​ER-21 (1:15 000 в 3% BSA; Джеффри Грин, Чикагский университет, Чикаго, Иллинойс), биотинилированная козья противокроличья сыворотка (1: 200 в BSA) в течение 1 ч, затем ABC-щелочная фосфатаза реагент в течение 1 ч (Vector Labs, Burlingame, CA).Слайды были промывают 0,1 м Трис (pH 9,5) и инкубируют в темноте в течение 1,5 ч в 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфате / нитробинем реагент тетразолиевый субстрат (SK-5400; Vector) с левамизолом.

Уровни эстрогена в сыворотке.

Кровь собирали периорбитальной пункцией в гепаринизированные пробирки и центрифугированные; эстроген в сыворотке крови определяли с помощью RIA (диагностический Products, Лос-Анджелес, Калифорния), модифицированный для мышиной сыворотки. (16) .

Гибридизация in situ для экспрессии HPV16 E6 / E7 и контрольную мРНК проводили, как описано ранее. (14 , 17) . Срезы выставлялись в течение 1 месяца, разворачивались и контрастировали с H&E.

Микроскопическая визуализация и статистический анализ.

Микроскопические изображения были получены с помощью микроскопа Leica DMRXA. оснащен цифровой камерой Spot (Diagnostic Instruments, Inc.). Изображения были созданы с помощью Adobe Photoshop 5.5 (Сан-Хосе, Калифорния). Числовые данные представлены как среднее ± стандартное отклонение и были статистически проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и χ ² анализ с использованием программного обеспечения Graph Pad 2 (Сан-Диего, Калифорния).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Местоположение плоскоклеточного канцерогенеза зависит от Доза эстрогена.

Для исследования порога эстроген-индуцированного репродуктивного плоскоклеточный канцерогенез тракта, различные группы трансгенных K14-HPV16 и нетрансгенных мышей лечили с интервалами до 6 месяцев те же дозы гормонов, которые использовались в предыдущих экспериментах (14) и более низкие дозы гормонов (Таблица 1 ⇓ и рис.1 ⇓ ). Таблица 1 ⇓ определяет общее количество трансгенных и нетрансгенных мышей, начинающих лечение в каждой группе и подмножестве трансгенных и нетрансгенных мышей, получавших каждую дозу 17β-эстрадиола в течение 6 месяцы. Эта часть исследования была разработана для определения местоположения рака репродуктивного тракта; таким образом, вывод заболеваемости раком Доза против недоступна. Частотное распределение количество раковых заболеваний, возникающих на разных уровнях репродуктивный тракт значительно отличался у мышей, получавших либо с 0.25 или 0,10 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол по сравнению с трансгенные мыши, получавшие 0,05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол (рис. 1) ⇓ . Трансгенные мыши, получавшие 0,25 или 0,10 мг / 60 дней 17β-эстрадиол преимущественно развивал плоскоклеточный рак вульвы, влагалище и нижняя / внешняя шейка матки (рис.1, a и c ⇓ , и Рис.1 b ⇓ , панели 1–3 соответственно). В Напротив, 0,05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол индуцировал плоскоклеточный рак, который были почти исключительно локализованы в зоне трансформации, расположенной между верхней шейкой матки и нижней маткой (рис.1 б ⇓ , панель 4 , а фиг.1 c ⇓ ). Несмотря на обширное вторжение в нижележащие стромальные ткани, ни одна из трансгенных мышей, подвергшихся лечению при любой дозе 17β-эстрадиола развились метастазы в лимфатических узлах. В 0,01 мг / 60-дневная доза 17β-эстрадиола не повлияла на репродуктивную функцию. плоский эпителий тракта трансгенных или нетрансгенных мышей по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо, сопоставимой по стадиям течка (рис.1 б ⇓ , панели 5 и 6 , и вставки в нее ).Нетрансгенных мышей, получавших каждый В дозе 17β-эстрадиола развилось утолщение плоского эпителия. соответствует доброкачественной гиперплазии (рис.1) ⇓ . Ни один из нетрансгенных у мышей, получавших любую дозу эстрогена, развилась неоплазия или злокачественное новообразование (данные не показаны и рис. ⇓ ). Спонтанная патология репродуктивного тракта не развивались у трансгенных мышей, получавших плацебо.

Разные дозы эстрогена вызывают раковые заболевания. по всему репродуктивному тракту. a , схема репродуктивный тракт самок мышей с указанием анализируемых областей. b , гистопатология репродуктивного тракта через 6 месяцев лечение разными дозами 17β-эстрадиола. Панели 1 и 2 , рак вульвы и влагалища в трансгенные мыши, получавшие 0,25 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол ( наконечник стрелки, обозначают степень рака). Панель 3 , инвазивный рак, заменяющий всю внешнюю шейки матки у трансгенной мыши, получавшей 0,10 мг / 60 дней 17β-эстрадиол. Панель 4 , зона мультифокальной трансформации рак ( стрелка ) и обширная железистая гиперплазия и мультифокальная плоскоклеточная метаплазия у трансгенной мыши, получавшей 0.05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол. Зоны трансформации в трансгенные мыши, получавшие 0,01 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол ( панель 5 ) или плацебо (мышь в течке; панель 6 ) демонстрируют легкое утолщение плоского эпителия, но нет железистая гиперплазия или вторжение в нижележащую строму путем разветвления нижние маточные железы как в панель 4 . Слитки во всех панелях = 200 мкм; бар дюйма вставки в панели 5 и 6 = 20 мкм. c , частота распространение рака, вызванного различными постоянными дозами 17β-эстрадиол в каждом анатомическом участке репродуктивного тракта.В общее количество мышей с раком в каждой группе дозирования указано в ключ вверху слева панели. Ни рака, ни дисплазия, развившаяся у любой мыши, получавшей 0,01 мг / 60 дней 17β-эстрадиол, или у любой нетрансгенной мыши.

Общее количество исследуемых мышей и подгруппа мышей, получавших 17β-эстрадиол 6 месяцев

Аналогично нашему предыдущему исследованию (14) , эстроген лечение вызвало смертность как у трансгенных, так и у нетрансгенных мышей (Таблица 1) ⇓ .Смертность во время лечения эстрогенами была связана с мочеиспусканием. расширение мочевого пузыря как у трансгенных, так и у нетрансгенных мышей. мышей серьезно пострадавшие от дисфункции мочевого пузыря были немедленно принесены в жертву для гистопатологического анализа репродуктивного тракта и были обозначены как «смертность». Смертельные случаи при приеме 0,25 мг / 60-дневного приема 17β-эстрадиола группы возникли уже через 2,5 мес лечения, тогда как все незапланированные смерти в группах 0,1 и 0,05 мг / 60 дней 17β-эстрадиола произошло через 5–6 месяцев лечения.Таким образом, расчет смертность для всей группы мышей, охватывающей все исследование разбавленные оценки смертности для более низких доз эстрогена из-за включение ранних временных точек (таблица 1) ⇓ . Поэтому мы проанализировали небольшая группа трансгенных и нетрансгенных мышей, получавших эстроген за 6 месяцев (таблица 1) ⇓ . Смертность в дозах 0,25 и 0,10 мг / 60 дней. Групп 17β-эстрадиола было больше, чем сообщалось ранее для эта модель (14) и могло быть из-за эффектов модификатора инбредной линии FVN / n (см. «Обсуждение»).Хотя был нет статистически значимой разницы в смертности между группами, была четкая тенденция к снижению смертности мышей, получавших 0,05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол (см. «Обсуждение»). Несмотря пошаговое сечение мочевого пузыря и уретры, наш анализ не дал выявить дискретную точку обструкции мочевого пузыря (данные не показаны). Там не было существенной разницы в смертности между трансгенными и нетрансгенных мышей, и ни одна из мышей, получавших 0,01 мг / 60 дней 17β-эстрадиол умер (Таблица 1) ⇓ .

Для определения влияния каждой дозы эстрогена на гормон крови уровни, сыворотка была получена от трансгенных и нетрансгенных мышей лечили в течение 7 недель 60-дневным гормоном высвобождения или гранулами плацебо (Рис. 2) ⇓ . Предыдущие исследования производителя гранул продемонстрировали постоянную высвобождение гормона без эффекта «пика и спада» в начале и конец 60-дневного интервала дозирования (18) . По сравнению с плацебо, дозы 0,25 и 0,10 мг / 60 дней повышали уровень эстрогена в сыворотке В 11–21 и 6–15 раз соответственно.Хотя не было статистически значимое повышение уровня продуцируемого эстрогена в сыворотке дозой 17β-эстрадиола 0,05 мг / 60 дней по сравнению с у мышей, получавших плацебо, диэструс, повышение уровня сывороточного гормона на 50% уровень в этой группе, скорее всего, был биологически значимым (рис. 2) ⇓ . Кроме того, кумулятивный гистопатологический анализ репродуктивного тракта все трансгенные и нетрансгенные мыши, получавшие 0,05 мг / 60 дней 17β-эстрадиол показал, что эта доза предотвращает цикл течки, тогда как эффекты прогестерона наблюдались у мышей, получавших 0.01 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол.

Диаграмма рассеяния распределения эстрогенов в сыворотке крови уровни у мышей в начале и в середине цикла течки или лечили различными непрерывными дозами 17β-эстрадиола. Трансгенных и нетрансгенных мышей лечили 17β-эстрадиолом для За 7 недель до взятия пробы на уровень эстрогена в сыворотке. мышей обработанные 0,25 и 0,10 мг 17β-эстрадиола высвобождаются в течение 60 дней показали 11–21- или 6–15-кратное повышение уровня эстрогена в сыворотке крови, соответственно.Хотя уровни эстрогена в сыворотке у мышей, получавших 0,05 Уровень 17β-эстрадиола в мг / 6 дней не был повышен статистически значимо. по сравнению с нелеченными мышами в начале цикла течки ( диэструс ), среднее повышение уровня гормона сыворотки на 50% уровней в этой группе было достаточно, чтобы поместить обработанных мышей в стойкие течка. a , мг 17β-эстрадиола на 60-дневную дозу.

Временной ход трансформации зоны канцерогенеза.

Остальная часть исследования была сосредоточена на выяснении биологии канцерогенеза зоны многоступенчатой ​​трансформации, индуцированного лечением трансгенных и нетрансгенных мышей с 0.05 мг / 60 дней 17β-эстрадиол. Здесь заболеваемость раком определялась серийным умерщвление трансгенных и одновременных нетрансгенных контрольных мышей в промежуточные временные точки опухолевого прогрессирования — 1, 3, 4 и 5 месяцев гормонального лечения — включая 6-месячный курс гормонального лечения группа, рассмотренная выше (рис. 3) ⇓ . Рак зоны трансформации впервые был обнаружен через 4 месяца после начала лечения. лечение у 30% трансгенных мышей и увеличилось до 60% через 5 месяцев и 91% после 6 месяцев гормонального лечения (рис.3 a ⇓ также см. «Обсуждение»). Рис.3 b ⇓ иллюстрирует гистопатологию репродуктивного тракта Нетрансгенные, обработанные 17β-эстрадиолом ( панель, 1 , 3 , 5 и 7 ) и трансгенные ( панели 2 , 4 , 6 и 8 ) мышей. Через 1 и 4 месяца лечения наблюдалось прогрессирующее увеличение толщины и проксимальное распространение плоского эпителий в нижнюю часть матки у трансгенных животных по сравнению с нетрансгенные мыши (рис.3 б ⇓ , панели 1–4 ). В кроме того, плоская метаплазия была очевидна в нижних железах матки, особенно в репродуктивных трактах трансгенных мышей (см. наконечник стрелки на рис.3 b ⇓ , панель 4 ). Метапластические нижние железы матки были отделены от анатомической плоско-столбчатое соединение столбчатым эпителием (рис. 3 b ⇓ , панели 4 , 6 и 8 ). Через 5 месяцев Лечение 17β-эстрадиолом, зона трансформации обоих Нетрансгенные и трансгенные мыши демонстрировали обилие нижних маточные железы.Эти железы были гиперпластическими, с обширными ветвями. проникая в строму (рис. 3 b ⇓ , панель 5 и 6 , и рис. 3 c ⇓ ). В трансгенных мышей в этих гиперпластические железы и были источником дисплазии высокой степени и мультифокальные плоскоклеточные карциномы (рис.3 b ⇓ , панель 6 , и рис. 3 c ⇓ , нижняя панель ). Через 6 месяцев гормонального лечения, было дальнейшее увеличение количества и стромальное расширение желез зоны трансформации у нетрансгенных мышей (Инжир.3 б ⇓ , панель 7 ) и более обширная железистая плоскоклеточная метаплазия и инвазия в строму мультифокальным плоскоклеточным карциномы у трансгенных мышей (рис. 3 b ⇓ , панель 8 ).

Заболеваемость раком и многоступенчатая гистопатология зона трансформации канцерогенеза. a , заболеваемость и начало рака зоны трансформации у трансгенных мышей, получавших лечение в 1 месячного возраста с 0,05 мг / 60-дневным 17β-эстрадиолом по показаниям интервалы. b , гистопатология многоступенчатая зона трансформации канцерогенеза в трансгенных ( панель) 2 , 4 , 6 и 8 ) и нетрансгенные ( панель 1 , 3 , 5 и 7 ) мышей. Через 1 месяц гормона лечение, наблюдается гиперплазия плоского эпителия в обоих нетрансгенные ( панель 1 ) и трансгенные ( панель 2 ) мышей. После 4 месяцев лечения увеличился плоскоклеточный гиперплазия, эпителиальный папилломатоз, дисплазия и плоскоклеточный метаплазия ( наконечник стрелки ) очевидна у трансгенных ( панель 4 ) по сравнению с нетрансгенными ( панель 3 ) мышей.После 5 месяцев лечения нижние маточные железы в Нетрансгенные мыши были гиперпластичны ( панель 5 , стрелка ; область при увеличении c , верхняя панель ), тогда как метаплазия, дисплазия и плоскоклеточный рак присутствовал в соответствующей области у трансгенных мыши ( панель 6 , стрелка ; область увеличено в c , нижняя панель ). Следующие 6 месяцев гормонального лечения, гиперплазия нижних желез матки и дальнейшее увеличение гипертрофии у нетрансгенных мышей (панель 7 ), тогда как мультифокальный плоскоклеточный рак заменяет почти вся зона трансформации у трансгенных мышей ( панель 8 ). c , гиперпластические нижние маточные железы в нетрансгенном мышь ( верхняя панель ) и мультифокальная в situ плоская железистая метаплазия, дисплазия и рак в трансгенная мышь ( нижняя панель ). Прутки = 100 мкм.

Метаплазия зоны трансформации возникает из субколонки Железистые резервные клетки.

Для дальнейшего исследования происхождения метаплазии во время зона трансформации канцерогенеза, экспрессия кератина-14, а маркер плоских эпителиальных клеток (рис.4) ⇓ . Через 1 месяц лечения 17β-эстрадиолом зоны трансформации в как трансгенные, так и нетрансгенные мыши продемонстрировали очаговый кератин-14 экспрессия в пределах двух-трех нижних маточных желез (рис. ⇓ , панели 1 и 2 ). Метапластические нижние маточные железы были отделены от плоского эпителия шейки матки значительным длина промежуточного столбчатого эпителия (рис. ⇓ , панель 1 и 2 ). После 6 месяцев гормонального лечения зоны трансформации у трансгенных мышей показали увеличение частота метапластов нижних маточных желез (рис.4 ⇓ , панель 4 ). Более высокое увеличение зоны трансгенной трансформации выявили мультифокальную плоскоклеточную метаплазию в нескольких различных нижних маточные железы, а также отдельные нижние железы матки (Рис. 4 ⇓ , панель 5 ). Метапластические очаги возникли из единичные клетки, расположенные на эпителиально-стромальном интерфейсе (рис. 4) ⇓ , панель 5 вставка ). Напротив, плоскоклеточная метаплазия была снижается в зоне трансформации нетрансгенных мышей (рис.4 ⇓ , панель 3 ).

Паттерны экспрессии кератина-14 на многоступенчатом зона трансформации канцерогенеза. После 1 месяца приема эстрогена лечения, имеются рассеянные метапластические нижние железы матки экспрессия кератина-14 в обоих нетрансгенных ( панель 1 ) и трансгенные (, панель 2, ) мыши. Через 6 месяцев лечение эстрогенами, степень нижней части матки и верхней шейки матки экспрессия кератина-14 снижается у нетрансгенных мышей (панель 3 ) по сравнению с аналогами, получавшими лечение в течение 1 месяца.Зона трансформации плоскоклеточной метаплазии обширна в трансгенных мыши ( панель 4 , стрелки ; указать область увеличена на панель 5 ). Мультифокальный плоскоклеточный метаплазия возникает в нескольких железах и в нескольких местах в каждой сальник ( панель 5 , стрелка ; сальник увеличено в , врезка ). Экспрессия кератина-14 в одном базальные клетки, непосредственно прилегающие к строме ( вставка , панель 5 ) соответствует резервно-клеточной плоскоклеточной метаплазия. Штанги : панели 1–4 = 200 мкм; панель 5 = 100 мкм; вставка = 20 мкм.

Пролиферация и экспрессия трансгена в зоне трансформации Канцерогенез.

Одно объяснение локализации зоны трансформации канцерогенез был бы очаговым увеличением пролиферации. Плоскоклеточный пролиферацию эпителия количественно оценивали путем подсчета зоны трансформации Ядра, меченные BrdUrd, по сравнению с отдельным перечислением BrdUrd-положительные клетки в цервикальном канале.Перечисление скорее чем было выполнено определение индекса инкорпорации, поскольку архитектура зоны трансформации была сложной, охватывая извитые железы и множественные типы клеток. От 1 до 6 месяцев гормональной терапии наблюдалось статистически значимое увеличение зоны трансформации ядер S-фазы трансгенных мышей по сравнению с нетрансгенные мыши (данные не показаны, а на рис. ⇓ ). Репрезентативные иммуногистохимические срезы тканей продемонстрировали, что эстроген индуцировал увеличение BrdUrd-положительных клеток в обоих плоский эпителий и строма у трансгенных мышей по сравнению с нетрансгенные мыши.Подстолбчатые ячейки, напоминающие резервноподобные, или кератиноциты чаще находились в S-фазе у пациентов, получавших эстроген. трансгенных по сравнению с нетрансгенными мышами (рис. 5). ⇓ , наконечники стрел ).

Структура и распределение пролиферативных клеток в зона трансформации у трансгенных и нетрансгенных мышей, получавших 0,05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол. Определение S-фазы нижней части матки клетки железистого эпителия в зоне трансформации нетрансгенного ( A и C ) и трансгенные мыши ( B и D ) 2 часа после i.п. инъекция 100 мкг / кг BrdUrd. Через 1 месяц лечения 17β-эстрадиолом нет разницы в количестве ячеек S-фазы в обоих нетрансгенные ( A ) или трансгенные ( B ) мыши. После 6 месяцев гормонального лечения количество ядер S-фазы уменьшается. заметно увеличено у трансгенных ( D ) по сравнению с нетрансгенные ( C ) мыши. У трансгенных мышей S-фаза ядра обнаруживаются как в строме, так и в железистом эпителии. Ядра S-фазы в железистом эпителии преимущественно находятся в базальный слой, и большинство из них имеют круглую или треугольную форму, соответствующую с плоскоклеточными клетками, а не столбчатыми (см. стрелки в D ). Прутки = 20 мкм.

Увеличение распространения может быть связано с усилением регулирования экспрессия трансгена в зоне трансформации, вызванной эстрогеном канцерогенез. Однако, как и в нашем предыдущем исследовании (14) , Экспрессия трансгена E6 / E7 HPV оставалась на уровне пороговый уровень выявления опухолей шейки матки в каждый момент времени прогрессия, без очагового увеличения в зоне трансформации по сравнению с другими частями репродуктивного тракта (данные не показаны). Гибридизация с рибозондом кератина-14 (14) и выбран другие факторы ядерной транскрипции продемонстрировали, что репродуктивная мРНК тракта была интактной (данные не показаны).

Паттерны экспрессии рецептора эстрогена во время трансформации Зональный канцерогенез.

Поскольку известно, что рецептор эстрогена-α стимулирует репродуктивную разрастание тракта (19 , 20) мы исследовали распределение экспрессии рецепторов иммуногистохимически. Эстроген белок рецептора-α был обнаружен как в базальном плоском эпителии, так и в лежащие в основе стромальные клетки как у нетрансгенных, так и у трансгенных мышей через 1 месяц лечения 17β-эстрадиолом (рис.6 ⇓ , панели 1 и 2 соответственно). Через 6 месяцев гормональное лечение, популяции базальных и базалоидных клеток экспрессирующие рецептор эстрогена-α были заметно увеличены в трансгенных мышей по сравнению с нетрансгенными мышами, особенно в диспластический плоский эпителий (рис.6 ⇓ , панели 2 и 4 по сравнению с панель 5 ). В метапластических и диспластические нижние маточные железы трансгенных мышей, у которых столбчатые эпителий был сопоставлен с плоским эпителием, рецептор эстрогена-α выражение оказалось больше в первом по сравнению с последний.Экспрессия рецептора эстрогена-α также была очевидна в плоский эпителиальный компонент злокачественных опухолей зоны трансформации (рис. ⇓ , панели 6 и 7 ).

Структура и распределение рецептора эстрогена-α экспрессия во время трансформации зоны канцерогенеза. Через 1 месяц лечение эстрогеном, экспрессия рецептора эстрогена-α обнаруживается в базальные и случайные супрабазальные клетки в плоском эпителии нетрансгенные и трансгенные мыши ( 1 и 3 ).После 6 месяцев лечения эстрогенами популяция эстрогеновых рецепторов-α-положительных базальных и супрабазальных клетки плоского эпителия увеличиваются при диспластических поражениях высокой степени у трансгенных ( 2 и 4 ) по сравнению с нетрансгенные мыши ( 5 ). В рамках индивидуальной диспластической железы, столбчатые клетки с высоким уровнем экспрессии рецептора эстрогена-α соседствуют с клетками плоского эпителия, которые, по-видимому, имеют более низкий уровни экспрессии рецепторов гормонов ( 2 ).Эстроген экспрессия рецептора-α сохраняется при инвазивном плоскоклеточном раке ( 6 и 7 ). Пунктирные линии дюйма 1–4 указывают эпителиально-стромальные соединения; твердый линии в 6 указывают гнезда злокачественных клеток. Экспрессия рецептора эстрогена-α также очевидна в стромальных ядрах при все моменты времени. Прутки = 20 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Используя титрование гормонов, мы уточнили наше предыдущее исследование, создание модели цервикального канцерогенеза, происходящего изнутри плоскоклеточная метаплазия в зоне трансформации трансгенного K14-HPV16 мышей.Хотя эта модель близко имитирует человеческое заболевание, есть особенности, уникальные для его создания, которые относятся к системе. В в частности, канцерогенез шейки матки вызывается постоянным воздействием к эстрогену. Хотя доза 17β-эстрадиола не приводила к повышение уровня гормонов сыворотки в несколько раз, повышение на 30–40% уровня гормонов в сыворотке крови было достаточно, чтобы поместить этих мышей в стойкая течка (данные не представлены). Таким образом, наш анализ сыворотки уровни гормонов послужили поводом для будущих экспериментов, чтобы проверить, спонтанный цервикальный канцерогенез может происходить у взрослых трансгенных мышей путем индукции стойкой течки, используя модель неонатального лечение эстрогенами (21) .Обструкция мочевыводящих путей вторичная по отношению к Расширение мочевого пузыря также является сопутствующим действием постоянного эстрогена. лечение. Действительно, 30–45% смертность мышей, получавших 0,25 и 0,10 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол был неожиданно выше, чем наш предыдущее исследование (14) . Одно из объяснений этого результата: что наше настоящее исследование проводилось на трансгенных и нетрансгенных однопометники, скрещенные с штаммом FVB / n в течение 24–25 поколений, тогда как в нашем предыдущем исследовании использовались мыши с n = 13–14 в FVB / n (14) .Хотя 10 поколений обратного скрещивания достаточно для создания конгенных штаммов (22) , это возможно, что локус модификатора, тесно связанный с трансгеном, был отвечает за повышенную чувствительность к 17β-эстрадиолу. Действительно, полиморфизмы, такие как дифференциальное метилирование эстрадиола, были описаны у людей и предположительно являются фактором восприимчивости в гормональном канцерогенезе (23 , 24) . Кроме того, степень и расположение гидроксилирования эстрогена также сообщалось потенциально могут играть роль в прямой генотоксичности (9 , 25) или цитотоксичность и ингибирование ангиогенеза (26) .Таким образом, частота обструкции мочевого пузыря была основная мотивация для тестирования дальнейшего снижения дозы как канцерогенных индукция и сопутствующее уменьшение этого осложнения. Мы уверены, что 21% смертность мышей, получавших 0,05 мг / 60-дневный 17β-эстрадиол действительно снижает смертность, поскольку дальнейшие исследования с этой моделью, используя большие когорты трансгенных и нетрансгенных мышей, продемонстрировали, что 6 месяцев гормонального лечения этой дозой может быть выполнено с 0–10% смертность. ⁴ Кроме того, имеем предварительные данные по межвидовым гибридам F ₁ предполагая, что фон FVB / n может быть более приемлемым для эстроген-индуцированный канцерогенез шейки матки по сравнению с другими инбредными штаммов, что напоминает чувствительность FVB / n к эпидермальному канцерогенез (11 , 27) . Дальнейшее исследование также выявило 30–80% (широкий диапазон из-за небольшого числа) частота инвазивных рак шейки матки после 4,5 месяцев гормонального лечения без смертность. ⁴ Эти новые данные предполагают что исследования более короткой продолжительности могут быть разработаны для проверки либо генетическое дополнение или химиопрофилактика канцерогенеза шейки матки.

Плоскоклеточная метаплазия, по-видимому, является первой стадией зона трансформации канцерогенеза как в нашей модели, так и в клинической болезнь. Хотя расположение зоны трансформации у мышей находится в соединение верхней шейки и нижней части матки, в отличие от части шейки матки у людей, есть данные, указывающие на железистые резервные клетки при заболеваниях человека (28, 29, 30) , как мы подозреваемый в нашей модели трансгенных мышей. Например, оба эктоцервикальных и эндоцервикальные клетки можно культивировать из шейки матки человека (31) .Хотя эндоцервикальные клетки происходят из эндоцервикальные железы, выстланные столбчатым эпителием, они также производят колонии, которые одновременно экспрессируют плоскоклеточный маркер кератин-14 и столбчатый маркер кератин-18 (31) . Трансплантация эндоцервикальных клеток иммунодефицитным хозяевам формирует монослои, напоминающие незрелую плоскоклеточную метаплазию, тогда как трансплантация эктоцервикальных клеток дает хорошо дифференцированные, многослойный плоский эпителий (31) . Чаще всего считалось, что происхождение железистой метаплазии — это миграция и замена железистого столбчатого эпителия соседним плоскоклеточным клетки.Последние данные свидетельствуют о том, что повышенная подвижность клеток, возможно, способствует связыванию Е6 ВПЧ с паксиллином (32) , мая способствуют этому явлению. Однако развитие мультифокального плоскоклеточная метаплазия на удалении от плоскоколончатого сочленения в наша модель согласуется с возможностью того, что шейный канцерогенез может происходить из отдельных железистых резервных клеток (29 , 31) .

Плоскоклеточная метаплазия также более обширна при лечении эстрогенами. трансгенных по сравнению с нетрансгенными мышами.Плоская метаплазия вызывается во влагалище и шейке матки снижением pH (1) . Закисление эпителия происходит в подростковом возрасте по мере того, как в результате повышенной выработки эстрогенов, бактериальной флоры влагалища изменения и эпителиальные ранения (1 , 33) . Дрожжи двухгибридный скрининг продемонстрировал связывание пируваткиназы M2 с HPV16 E7 (34) . HPV E7 стабилизирует димер по сравнению с тетрамерная форма пируваткиназы M2 (34) . Субстрат утилизация димерной пируваткиназой M2 сдвигает внутриклеточную глюкозу метаболизм к аэробному гликолизу, а не к циклу трикарбоновых кислот окисление (34) .Одна из гипотез, предложенная этими биохимические данные свидетельствуют о том, что E7-опосредованный внутриклеточный ацидоз из-за Накопление лактата может быть сигналом, который способствует плоскоклеточному решение судьбы железистых резервных клеток в трансгенных мышей, получавших эстроген.

Некоторые особенности нашей нынешней модели предполагают, что комбинация автономных клеток и факторов, не являющихся автономными клетками, сговариваются, чтобы вызвать зона трансформации канцерогенеза шейки матки. Экспрессия эстрогена рецептор-α и онкогены ВПЧ (14) в том же базальном популяция клеток предполагает автономный вклад клеток в плоскоклеточный эпителиальная дисплазия и последующий инвазивный рак.Есть ряд молекулярных сценариев, преимущественно включающих параллельные пути, для передача сигналов рецептора эстрогена-α для синергизма с клеточными эффектами онкобелков HPV16. Например, увеличение активности E2F вторичный по отношению к дестабилизации pRB под действием HPV E7, активирует сбор гены, включая тимидилаткиназу и дигидрофолатредуктазу, увеличение пулов нуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК эстрогеном гены-мишени рецептора-α (35) . Синергизм между эстрогенами рецептор-α и ВПЧ также могут возникать на уровне эпителиального рецептор фактора роста, рециклинг клеточной поверхности которого повышен онкопротеином Е5 ВПЧ (36, 37, 38) .Повышающее регулирование Транскрипционная активность рецептора эстрогена-α может быть произведена Опосредованная рецептором эпителиального фактора роста активация MAP киназный путь, который может напрямую фосфорилировать рецептор гормона (39) . Непрямое взаимодействие между онкобелками ВПЧ и трансактивация рецептора эстрогена-α может также происходить на уровне ремоделирования хроматина. Связанные с лигандом ядерные рецепторы привлекают коактиватор (ы), которые обладают гистонацетилазной активностью по отношению к ДНК (40) . Ацетилирование гистонов хроматина увеличивается доступ к механизмам транскрипции ДНК (40) .Наоборот, Репрессия транскрипции белка ретинобластомы опосредуется привлечение гистондеацетилазы к ДНК (41) . ВПЧ E7 нарушает комплексообразование между гистондеацетилазой и белок ретинобластомы (42) . Таким образом, HPV E7 может дополнительно увеличить доступ хромосомной ДНК к элементам ответа рецептора эстрогена. Неклеточное автономное сотрудничество между лиганд-активированным эстрогеном рецептор-α и онкобелки ВПЧ также могут встречаться. Метапластический плоский эпителий возникает из сильно разветвленного, гиперпластического, нижнего маточные железы, вызванные хроническим лечением низкими дозами эстрогенов.Эти структуры, вероятно, образуются в результате стромально-эпителиальных взаимодействий в зоне трансформации мышей, получавших эстроген, возможно координируется транскрипцией и высвобождением факторов роста из лежащая в основе строма в ответ на активацию рецептора эстрогена-α посредством лиганд. Индукция дисплазии вышележащего плоского новообразования эпителий трансгенных мышей может опосредоваться плоским эпителиальным нарушение регуляции клеточного цикла и измененная стабильность генома, опосредованная ВПЧ E7 и E6 (43) .

Таким образом, аналогично болезни человека, зона трансформации канцерогенез у трансгенных мышей K14-HPV16, получавших эстроген, нельзя объясняется одной молекулярной особенностью; скорее, это многофакторный (Рис.7) ⇓ . Хроническое лечение эстрогенами стимулирует развитие гиперплазии. нижние маточные железы. Эти железы становятся «плодородной почвой», способствуя развитию плоскоклеточная метаплазия и опухолевое прогрессирование. Железисто-стеблевидный резервные клетки могут экспрессировать низкий уровень кератина-14 (31) а у трансгенных мышей — онкогены ВПЧ.Взаимодействие HPV16 E7 онкопротеин с пируваткиназой M2 может вызывать снижение внутриклеточный pH (34) , потенциально смещая железистый решение судьбы резервных клеток в сторону метапластического плоскоклеточного, а не столбчатый эпителий (Ref. 1 и рис.7 ⇓ ). Непрерывный HPV E6 и экспрессия онкогена E7 может вызывать стойкий клеточный цикл нарушение регуляции (44) и способствовать генетической нестабильности (45) . Передача сигналов рецептора эстрогена-α в плоскоклеточном эпителиальные клетки, между железистыми столбчатыми и метапластическими плоскоклеточными клетки, а выработанные из подлежащей стромы могут в дальнейшем способствовать канцерогенезу.Это исследование готовит почву для выяснения клеточного автономные и не-клеточные автономные вклады в зону трансформации канцерогенез с использованием генетического дополнения или фармакологического лечение, будь то противоопухолевые или химиопрофилактические, которые нацелены на каждый элемент этой модели.

Модель зоны трансформации, вызванной эстрогенами канцерогенез. Железистые резервные клетки могут дифференцироваться в столбчатых или плоскоклеточных клеток. После решение судьбы плоскоклеточных клеток, комбинация клеток автономные и без ячеек автономные факторов способствуют многоступенчатому канцерогенезу в метапластических железах.

Благодарности

Мы благодарим Фрэнка Маккормика, Кита Ямамото, Аллана Балмейна и Джо. Грею за рецензирование рукописи и Роберту Кардиффу за полезные обсуждения.

Сноски

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• ↵1 При поддержке гранта R01-CA-71398 и частично Грант NO1-CN-75106, оба из Национального института рака.

• №2 Кому должны быть отправлены запросы на перепечатку адресовано, в онкологическом центре UCSF, 2340 Sutter Street, Box 0808, San Франциско, Калифорния 94143-0808. Телефон: (415) 502-3292. Факс: (415) 476-8218; Эл. Почта: jarbeit {at} cc.ucsf.edu

• ↵3 Используемые сокращения: ВПЧ, человек. папилломавирус; BrdUrd, 5-бром-2-дезоксиуридин.

• 4 Неопубликованные данные.

• Получено 30 сентября 1999 г.
• Принято 5 января 2000 г.

• © 2000 Американская ассоциация исследований рака.

Ссылки

1. ↵

   Джордан Дж., Певица А. Шейка матки 87-104, The Whitefriars Press Limited, Лондон 1976.

2. ↵

   Берчмайер К., Мейер Д., Ритмахер Д. Факторы, контролирующие рост, подвижность и морфогенез нормальных и злокачественных эпителиальных клеток. Int. Преподобный Cytol., 160 : 221-226, 1995.

3. ↵

   Ким Р., Вайсфельд Дж. Л., Рейнольдс Дж. К., Куллер Л. Х. Этиология метаплазии Барретта и аденокарциномы пищевода [см. Комментарии]. Cancer Epidemiol. Биомарк. Пред., 6 : 369-377, 1997.

4. ↵

   Хирота В.K., Loughney T. M., Lazas D. J., Maydonovitch C. L., Rholl V., Wong R.K. Специализированная кишечная метаплазия, дисплазия и рак пищевода и пищеводно-желудочного перехода: распространенность и клинические данные. Гастроэнтерология, 116 : 277-285, г. 1999.

5. ↵

   Kuipers E.J. Обзорная статья: взаимосвязь между Helicobacter pylori , атрофическим гастритом и раком желудка. Алимент. Pharmacol. Ther., 12 (Дополнение 1) : 25-36, 1998 г.

6. ↵

   zur Hausen H. Вирус папилломы человека в патогенезе аногенитального рака. Вирусология, 184 : 9-13, 1991.

7. ↵

   De Villers E. Тип патогенного вируса папилломы человека: обновленная информация. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол., 186 : 1-12, 1994.

8. ↵

   Кинцлер К. В., Фогельштейн Б. Уроки наследственного колоректального рака.Клетка, 87 : 159-170, г. 1996.

9. ↵

   Оборн К., Вудворт К., ДиПаоло Дж., Брэдлоу Х. Взаимодействие между инфекцией ВПЧ и метаболизмом эстрогенов в канцерогенезе шейки матки. Int. J. Рак, 49 : 867-869, 1990.

10. ↵

    Arbeit J. Трансгенные модели эпидермальной неоплазии и многоступенчатого канцерогенеза. Cancer Surv., 26 : 7-34, 1996 г.

11. ↵

    Coussens L., Hanahan D., Arbeit J. Генетическая восприимчивость, изменения в дифференцировке и инвазии во время многоступенчатого плоскоклеточного канцерогенеза у трансгенных мышей K14-HPV16. Являюсь. J. Pathol., 149 : 1899-1917, 1996.

12. ↵

    Smith-McCune K., Zhu Y., Hanahan D., Arbeit J. Межвидовое сравнение ангиогенеза на предраковых стадиях плоскоклеточного канцерогенеза шейки матки человека и трансгенных мышей K14-HPV16.Cancer Res., 57 : 1294-1300, г. 1997.

13. ↵

    Arbeit J. M., Riley R. R., Huey B., Porter C., Kelloff G., Lubet R., Ward J. M., Pinkel D. Химиопрофилактика эпидермального канцерогенеза с помощью DFMO у трансгенных мышей K14-HPV16. Cancer Res., 59 : 3610-3620, г. 1999.

14. ↵

    Arbeit J., Howley P., Hanahan D. Хронический эстроген-индуцированный плоскоклеточный канцерогенез шейки матки и влагалища у трансгенных мышей HPV16.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 93 : 2930-2935, г. 1996.

15. ↵

    Arbeit J., Münger K., Howley P., Hanahan D. Прогрессирующая плоскоклеточная эпителиальная неоплазия у трансгенных мышей типа 16 с вирусом папилломы человека K14. J. Virol., 68 : 4358-4368, г. 1994.

16. ↵

    Christov K., Guzman R., Swanson S., Thordarson G., Talamantes F., Nandi S. Клеточная пролиферация и апоптоз во время канцерогенеза молочной железы у мышей с изотрансплантатом гипофиза.Канцерогенез (лонд.), 17 : 1741-1746, г. 1996.

17. ↵

    Arbeit J., Olson D., Hanahan D. Повышающая регуляция факторов роста фибробластов и их рецепторов во время многоступенчатого эпидермального канцерогенеза у трансгенных мышей K14-HPV16. Онкоген, 13 : 1847-1857, г. 1996.

18. ↵

    Катович М., О’Мира Дж. Влияние хронического эстрогена на температурный ответ кожи на налоксон у морфинзависимых крыс.Жестяная банка. J. Pharmacol., 65 : 563-567, 1987.

19. ↵

    Lubahn D., Moyer J., Golding T., Couse J., Korach K., Smithies O. Изменения функции репродуктивного тракта, но не пренатального полового развития после инсерционного нарушения гена рецептора эстрогена мыши. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 90 : 11162-11166, г. 1993.

20. ↵

    Корах К. Выводы из исследования животных, лишенных функционального рецептора эстрогена.Наука (Вашингтон, округ Колумбия), 266 : 1524-1527, г. 1994.

21. ↵

    Jones L., Bern H. Аномалии шейно-влагалищных и молочных желез у мышей BALB / cCrgl, получавших неонатально прогестерон и эстроген, по отдельности или в комбинации. Cancer Res., 39 : 2560-2567, г. 1979.

22. ↵

    Сильвер Л. Генетика мышей: концепции и приложения 44-52, Oxford University Press, Нью-Йорк 1995 г.

23. ↵

    Lavigne J., Helzlsouer K., Huang H., Strickland P., Bell D., Selmin O., Watson M., Hoffman S., Comstock G., Yager J. Связь между аллелями, кодирующими низкий вариант активности катехол- O -метилтрансферазы и риск рака груди. Cancer Res., 57 : 5493-5497, г. 1997.

24. ↵

    Томпсон П., Шилдс П., Фройденхайм Дж., Стоун А., Вена Дж., Маршалл Дж., Грэм С., Лафлин Р., Немото Т., Кадлубар Ф., Амброзон С. Генетические полиморфизмы в катехол- O -метлитрансферазе, статус менопаузы и риск рака груди. Cancer Res., 58 : 2107-2110, г. 1998.

25. ↵

    Сванек Г., Фишман Дж. Ковалентное связывание эндогенного 16α-гидроксиэстрона эстрогена с рецептором эстрадиола в клетках рака груди человека: характеристика и внутриядерная локализация.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 85 : 7831-7835, г. 1988.

26. ↵

    Fotsis T., Zhang Y., Pepper M., Adlercreutz H., Montesano R., Nawroth P., Schweigerer L. Эндогенный метаболит эстрогена 2-метоксиэстрадиол ингибирует ангиогенез и подавляет рост опухоли. Природа (Лонд.), 368 : 237-239, 1994.

27. ↵

    Хеннингс Х., Глик А., Лоури Д., Крсманович Л., Sly L., Yuspa S. Мыши FVB / n: инбредная линия, чувствительная к химической индукции плоскоклеточного рака кожи. Канцерогенез (лонд.), 14 : 2353-2358, г. 1993.

28. ↵

    Ивани Д., Гроеневельд Э., Ван Дорнеуард Г., Моой В. Дж., Хагеман П. С. Подтипы кератина при карциномах шейки матки: значение для гистогенеза и дифференциальной диагностики. Cancer Res., 50 : 5143-5152, г. 1990.

29. ↵

    Смедц Ф., Ramaekers F., Troyanovsky S., Pruszczynski M., Robben H., Lane B., Leigh I., Plantema F., Vooijs P. Кератины базальных клеток в резервных клетках шейки матки и сравнение с их экспрессией при цервикальной интраэпителиальной неоплазии . Являюсь. J. Pathol., 140 : 601-612, 1992.

30. ↵

    Воойс Г. П. Проблема замещения и дифференцировки кишечного эпителия: связь с плоскоклеточной метаплазией шейки матки. Рак (Phila.), 81 : 317-322, г. 1997.

31. ↵

    Цуцуми К., Сан К., Ясумото С., Кикучи К., Охта Ю., Патер А., Патер М. In vitro и in vivo анализ клеточного происхождения плоской метаплазии шейки матки. Являюсь. J. Pathol., 143 : 1150-1158, г. 1993.

32. ↵

    Тонг X., Хоули П. Онкопротеин вируса папилломы крупного рогатого скота E6 взаимодействует с паксиллином и разрушает актиновый цитоскелет.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 94 : 4412-4417, г. 1997.

33. ↵

    Рид Б. Л., Сингер А., Коплсон М. Процесс регенерации шейки матки после электрокаутеризации. I. Гистологическое и кольпоскопическое исследование. Aust. N. Z. J. Obstet. Gynaecol., 7 : 125-135, 1967.

34. ↵

    Цвершке В., Мазурек С., Массими П., Бэнкс Л., Эйгенбродт Э., Янсен-Дурр П. Модуляция активности пируваткиназы типа M2 онкобелком E7 вируса папилломы человека 16 типа.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 96 : 1291-1296, г. 1999.

35. ↵

    Chellappan S., Kraus V., Kroger B., Münger K., Howley P., Phelps W., Nevins JR Аденовирус E1A, опухолевый антиген вируса обезьяны 40 и белок E7 вируса папилломы человека обладают общей способностью нарушать взаимодействие между фактор транскрипции E2F и продукт гена ретинобластомы. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, 89 : 4549-4553, г. 1992.

36. ↵

    О’Мэлли Б.W., Schrader W. T., Mani S., Smith C., Weigel N. L., Conneely O. M., Clark J. H. Альтернативный лиганд-независимый путь активации стероидных рецепторов. Недавняя прог. Horm. Res., 50 : 333-347, г. 1995.

37. ↵

    Вейгель Н. Л., Чжан Ю. Лиганд-независимая активация рецепторов стероидных гормонов [см. Комментарии]. J. Mol. Мед., 76 : 469-479, г. 1998.

38. ↵

    Прямой S., Hinkle P., Jewers R., McCance D. Онкопротеин E5 вируса папилломы человека 16 типа трансформирует фибробласты и снижает регуляцию рецептора эпидермального фактора роста на кератиноцитах. J. Virol., 67 : 4521-4532, г. 1993.

39. ↵

    Бунон Г., Бриан П. А., Миксичек Р. Дж., Пикард Д. Активация нелигандированного рецептора эстрогена с помощью EGF включает путь киназы MAP и прямое фосфорилирование. EMBO J., 15 : 2174-2183, г. 1996 г.

40. ↵

    Сюй Л., Гласс К., Розенфельд М. Коактиваторные и корепрессорные комплексы в функции ядерных рецепторов. Curr. Opin. Genet. Dev., 9 : 140-147, 1999.

41. ↵

    Magnaghi-Jaulin L., Groisman R., Naguibneva I., Robin P., Lorain S., Le Villain JP, Troalen F., Trouche D., Harel-Bellan A. Белок ретинобластомы подавляет транскрипцию за счет рекрутирования гистондеацетилазы [см. комментарии].Природа (Лонд.), 391 : 601-605, г. 1998.

42. ↵

    Brehm A., Miska E. A., McCance D. J., Reid J. L., Bannister A. J., Kouzarides T. Белок ретинобластомы рекрутирует гистоновую деацетилазу для подавления транскрипции [см. Комментарии]. Природа (Лонд.), 391 : 597-601, г. 1998.

43. ↵

    Гахари А., Чакрабарти С., Мерфи Л. Локализация участков синтеза и действия инсулиноподобного фактора роста-1 в матке крысы.Мол. Эндокринол., 4 : 191–195, 1990.

44. ↵

    Scheffner M., Romanchuk H., Münger K., Huibregtse J., Mietz J., Howley P. Функции белков вируса папилломы человека. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол., 186 : 83-99, 1994.

45. ↵

    Галлоуэй Д., Демерс Г., Фостер С., Халберт К., Рассел К. Контроль контрольных точек клеточного цикла обходится онкогенами вируса папилломы человека.Колд-Спринг-Харбор Symp. Quant. Биол., 59 : 297-306, г. 1994.

Контуры патологии — Туннельные кластеры

Доброкачественные / неопухолевые эпителиальные поражения

Туннельные скопления

Главный редактор: Дебра Л. Зингер, MD

Тема завершена: 2 апреля 2020 г.

Незначительные изменения: 7 мая 2021 г.

Поиск в PubMed : кластеры туннелей [TIAB]

Просмотры страниц в 2020 году: 5,723

Просмотры страниц в 2021 году на сегодняшний день: 6,517

Цитируйте эту страницу: Турашвили Г. Туннельные кластеры. Сайт PathologyOutlines.com. https://www.pathologyoutlines.com/topic/cervixtunnelclusters.html. По состоянию на 4 ноября 2021 г.

Определение / общее

• Дольчатые агрегаты доброкачественных эндоцервикальных желез в стенке шейки матки

Основные характеристики

• Случайные находки
• Доброкачественное разрастание эндоцервикальных желез с дольчатой ​​конфигурацией
• Были описаны два типа (A и B):
  • Туннельные скопления типа А состоят из небольших некистозных желез и могут проявлять метаплазию желудка в 15% случаев.
  • Туннельные кластеры типа B состоят из кистозно расширенных желез

Кодировка ICD

• ICD-O: Не применимо
• МКБ-10: Не применимо.
• МКБ-11: Не применимо.

Клинические особенности

• Обычно бессимптомное течение
• Может быть связано со слизистыми выделениями
• Редко видна при кольпоскопическом исследовании

Факторы прогноза

• Отличный прогноз
• Отсутствие риска рецидива или злокачественной трансформации

Общее описание

• Туннельные кластеры A часто совершенно ничем не примечательны
• Кластеры туннеля B демонстрируют явно видимое дольчатое образование в 40% случаев и множественные поражения в 80% случаев
• Редкое расширение стенки шейки матки

Микроскопическое (гистологическое) описание

• Хорошо разграниченная, округлая, дольчатая пролиферация плотно упакованных канальцев разного размера, выстланных эндоцервикальным железистым эпителием
• Отсутствие десмопластической или воспалительной стромальной реакции
• Может быть связан с кистами Наботиана
• Обычно обнаруживается рядом с поверхностным эпителием шейки матки
• Тип A:
  • Небольшие удлиненные некистозные железы, выстланные столбчатыми или низко-кубовидными клетками с базально расположенными ядрами и апикальной муцинозной цитоплазмой
  • Легкая цитологическая атипия может проявляться псевдостратификацией, увеличением ядер, гиперхромазией, везикулярным хроматином или выступающими ядрышками (Am J Surg Pathol 1996; 20: 1312)
  • Минимальная митотическая активность или ее отсутствие
  • Метаплазия желудка с частотой до 15% (Histopathology 2007; 50: 843)
• Тип B («B» для больших):
  • Кистически расширенные железы, содержащие уплотненный муцин и выстланные кубовидным или уплощенным эпителием
  • Выстилающие клетки цитологически мягкие, с яйцевидными ядрами, лишенными митотической активности
• Можно смешивать туннельные кластеры типа A и типа B

Микроскопические (гистологические) изображения

Виртуальные слайды

Туннельные скопления и глубокие наботийские кисты

Альциановый синий / ПАСК в туннельных скоплениях и наботианских кистах

Туннельные кластеры

Описание цитологии

• Нет специфических цитологических признаков
• Доброкачественные эндоцервикальные железы

Образец отчета о патологии

• Туннельные кластеры не имеют клинического значения, и их не нужно упоминать в отчете о патологии

Дифференциальный диагноз

• Аденокарцинома минимального отклонения
  • Отсутствует дольчатая конфигурация
  • Состоит из желез неправильной формы, часто с глубоким расширением в шейной стенке
  • По крайней мере, очаговая стромальная десмоплазия и цитологическая атипия
  • Отрицательный для PAX2
• Эндоцервикальная аденокарцинома обычного типа
  • Демонстрирует инфильтративный рост с цитологической атипией, апикальными митотическими фигурами и апоптотическими тельцами, часто со стромальной десмопластической реакцией.
  • Диффузно положительный для p16
• Аденокарцинома in situ
  • Демонстрирует цитологическую атипию с псевдостратифицированными гиперхроматическими ядрами, апикальными митотическими фигурами и апоптотическими тельцами.
  • Диффузно положительный для p16
• Наботианские кисты
  • Показывает большие заполненные муцином кисты без дольчатой ​​конфигурации.
• Остатки мезонефрии / гиперплазия
  • Может проникать глубоко в стенку шейки матки
  • Железы часто содержат густые эозинофильные внутрипросветные выделения и выстланы кубовидными клетками без внутрицитоплазматического муцина
  • Положительный для GATA3 или TTF1

Вопрос стиля проверки совета директоров № 1

1. Положительный результат для PAX2, p16 и CEA, Ki67> 10%
2. Положительный результат для PAX2, p16 и CEA, Ki67> 10%, переменная HIK1083
3. Положительный результат на PAX2, отрицательный на p16 и CEA, Ki67 <1%, переменная HIK1083
4. Отрицательный для PAX2, p16 и CEA, Ki67 <1%

Вопрос стиля проверки совета директоров № 2

1. Положительный результат на PAX2, p16 и CEA, отрицательный на HIK1083, Ki67> 10%
2. Положительно для PAX2 и HIK1083, отрицательно для p16 и CEA, Ki67> 10%
3. Положительный результат на HIK1083, отрицательный на PAX2, p16 и CEA, Ki67 <1%
4. Положительный для PAX2, отрицательный для p16, CEA и HIK1083, Ki67 <1%