Удаление стержневой мозоли жидким азотом: Удаление мозолей жидким азотом в Минске

24.07.2000 alexxlab

Содержание

Удаление новообразований на коже лазером, жидким азотом

directions

В Медицентре производится удаление доброкачественных новообразований — родинок, папиллом, кондилом, липом и прочих. Удаление подошвенных бородавок требует большего давления, длится 30-60сек и повторяется несколько раз с интервалом в 3-5 дней. Удаление юношеских бородавок. Процедура длится 1-2 минуты и повторяется 3-4 раза.

В настоящее время на сайте ведутся работы по изменению прайс-листа, актуальную информацию уточняйте по тел: 640-55-25 или оставьте заявку, с Вами свяжется оператор.

Цены на услуги

Лечение контагиозного моллюска 1 категории (1 элемент на туловище диаметром до 3мм) 440a
Удаление кератомы 1 категории (1элемент диаметром до 3мм любой локализации) 440a

Удаление кондилом 1 категории (1 элемент любой локализации диаметром 1-2мм) 440a
Удаление папиллом 1 категории (1 элемент на туловище,шее, диаметром до 1 мм) 440a
Удаление обыкновенной бородавки 1 категории (1 элемент на туловище диаметром 1-2мм) 730a

Удаление прочих новообразований 1 категории (1 элемент диаметром до 4мм) 730a
Удаление поверхностно расположенных инородных тел менее 5мм 730a
Удаление подошвенной бородавки 1 категории (1 элемент диаметром до 4мм) 1170a

Удаление стержневых мозолей 1 категории (1 элемент диаметром до 4мм) 1170a
Лечение контагиозного моллюска 2 категории (1 элемент на лице диаметром до 3мм) 1265a

Удаление кератомы 2 категории (1 элемент диаметром более 3мм на туловище) 1265a
Удаление кондилом 2 категории (1 элемент любой локализации диаметром 2-5мм) 1265a
Удаление обыкновенной бородавки 2 категории (1 элемент на туловище диаметром 2-5мм) 1265a

Удаление папиллом 2 категории (1 элемент на туловище,шее диаметром более 1мм) 1265a
Лечение гемангиомы 1 категории (1элемент на туловище диаметром до 5мм) 1455a
Удаление гранулем,дерматофибром 1 категории (1 элемент диаметром менее 3мм любой локализации 1455a

Удаление кожного рога 1 категории (1 элемент любой локализации менее 2мм) 1455a
Удаление невуса 1 категории (1 элемент любой локализации диаметром 1-2мм) 1455a
Удаление пиогенных гранулем 1 категории (1 элемент диаметром до 2мм) 1455a
Удаление прочих новообразований 2 категории (1 элемент диаметром 4-7мм) 1455a
Удаление кератомы 3 категории (1 элемент диаметром более 3мм на лице) 1890a

Удаление кондилом 3 категории (1 элемент любой локализации диаметром 5-10мм) 1890a
Удаление обыкновенной бородавки 3 категории (1 элемент на туловище диаметром более 5мм) 1890a
Удаление папиллом 3 категории (1 элемент на лице диаметром до 1мм) 1890a

Удаление невуса 2 категории (1 элемент любой локализации диаметром 2-5мм) 2190a
Удаление подошвенной бородавки 2 категории (1 элемент диаметром 4-7 мм) 2190a
Удаление прочих новообразований 3 категории (1 элемент диаметром 7-10мм) 2190a

Удаление стержневых мозолей 2 категории (1 элемент диаметром 4-7мм) 2190a
Удаление обыкновенной бородавки 4 категории (1 элемент любого размера на лице) 2330a
Лечение контагиозного моллюска 4 категории (1 вторично инфицированный элемент) 2900a
Лечение гемангиомы 2 категории (1 элемент на лице диаметром до 5мм) 2900a
Удаление гранулем,дерматофибром 2 категории (1 элемент диаметром 3-5мм любой локализации) 2900a

Удаление кожного рога 2 категории (1 элемент на туловище диаметром 2-5мм) 2900a
Удаление кондилом 4 категории (1 элемент любой локализации более 10мм) 2900a
Удаление невуса 3 категории (1 элемент любой локализации диаметром 5-10мм) 2900a

Удаление папиллом 4 категории (1 элемент на лице диаметром более 1мм) 2900a
Удаление пиогенных гранулем 2 категории (1 элемент диаметром 2-5мм) 2900a
Удаление прочих новообразований 4 категории (1 элемент диаметром 11мм) 2900a
Удаление невуса 4 категории (1 элемент любой локализации диаметром 10-15мм) 3630a
Удаление подошвенной бородавки 3 категории (1 элемент диаметром 7-10мм) 3630a
Удаление стержневых мозолей 3 категории (1 элемент диаметром до 7-10мм) 3630a
Лечение гемангиомы 3 категории (1 элемент на туловище диаметром более 5мм) 5085a
Удаление гранулем,дерматофибром 3 категории (1 элемент диаметром более 5мм на туловище) 5080a
Удаление кожного рога 3 категории (1 элемент на лице диаметром 2-5мм) 5080a
Удаление пиогенных гранулем 3 категории (1 элемент диаметром 5-8мм) 5085a
Удаление подошвенной бородавки 4 категории (1 элемент диаметром более 10мм) 5810a
Удаление стержневых мозолей 4 категории (1 элемент диаметром более 11мм) 5810a
Удаление атеромы 2 категории (1 элемент на туловище более 10мм) 5810a
Удаление липомы 2 категории (1 элемент любой локализации диаметром более 20мм) 5800a
Лечение гемангиомы 4 категории (1 элемент на лице диаметром более 5мм) 7260a
Удаление гранулем,дерматофибром 4 категории (1 элемент диаметром более 5мм на лице) 7260a
Удаление кожного рога 4 категории (1 элемент любой локализации более 5мм) 7260a
Удаление пиогенных гранулем 4 категории (1 вторично инфицированный элемент) 7260a
Удаление атеромы 3 категории (1 элемент на лице диаметром до 10мм) 7260a
Удаление атеромы 4 категории (1 элемент на лице диаметром более 10мм) 8715a

Информация и цены, представленные на сайте, являются справочными и не являются публичной офертой.

Наши клиники в Санкт-Петербурге

Получить подробную информацию и записаться на прием Вы можете по телефону +7 (812) 640-55-25

Методы удаления новообразований

Хирургическое удаление. Позволяет избавиться от образований большого размера. Операция проходит под местной анестезией. Удалённый материал обязательно отправляется на гистологическое исследование. После удаления накладываются косметические швы. Метод позволяет полностью удалить новообразование, однако после заживления остаётся небольшой рубец.
Лазерное удаление. Проводится при помощи хирургического лазера «Алком». Он быстро и качественно удаляет нежелательные новообразования, сама процедура проводится под местной анестезией, практически безболезненна, даёт довольно быстрое заживление, не оставляет послеоперационных рубцов.
Удаление методом криодеструкции. Новообразования удаляются под действием жидкого азота. Операция проводится при очень низких температурах, после чего кожа быстро восстанавливается.
Удаление методом коагуляции. Процедура проводится с помощью специального аппарата — электро-волнового ножа «Фотек». Методика позволяет отправить удалённое образование на проведение исследования.

В каждом случае хирург на предварительной консультации индивидуально подбирает метод удаления в зависимости от величины и вида новообразования.

Удаление жидким азотом в Петербурге практически также популярно как и удаление лазером. Данный метод удаления называется криодеструкцией. Этот метод основан на удалении новообразований холодным газом, имеющим температуру — 196 градусов Цельсия.

Суть процедуры заключается в воздействии на больные ткани низкой температурой. Под воздействием азота межклеточная и внутриклеточная жидкость замерзает и клетка прекращает свою жизнедеятельность. Участок, который подвергается воздействию жидким азотом называется зоной крионекроза. Между этой зоной и здоровой зоной образуется граница. Основная задача хирурга правильно рассчитать эту границу.

Жидкий азот незаменим при удалении новообразований, он не оставляет даже следов на коже. В процессе процедуры можно наблюдать изменение цвета образования, а через несколько минут можно увидеть отек в области образования, затем в течении нескольких часов образуется пузырь. Пузырь держится около 6 дней. Затем пузырь начинает уменьшатся и на его месте образуется корочка, которая затем высыхает и отпадает. Полный процесс восстановления кожного покрова занимает примерно две недели.

В среднем процедура длится несколько минут. Затем наступает тепловое равновесие между тканью и воздействующим наконечником аппарата. Для разных целей используются разные наконечники для аппарата. Они выбираются таким образом, чтобы плоскости соприкосновения были параллельны.

Преимущества метода:

метод удаления бескровный, т. е. область наркоза не кровоточит,
не требуется обезболивания, так как низкая температура приводит к обезболивающему эффекту,
не остается рубцов, шрамов.

1440,1441,1363,1398,827,841

Брейкина Евгения Владимировна 24.09.2021 14:54
medi-center.ru

Добрый день, посетила Ваш центр на Жукова 28 корп.2 в связи с профосмотром. Хочу выразить благодарность медицинскому персоналу за профессионализм и внимательное отношение к пациентам, а также за отсутствие очередей. Спасибо!

Степанова Анна Николаевна 23.09.2021 14:03
medi-center.ru

Посетила Ваш центр впервые в связи с профосмотром. Огромное спасибо за профессиональное и внимательное отношение медицинского персонала, за отсутствие очередей, за чистоту в помещениях центра. Было очень приятно. Спасибо!

Уткина Евгения Игоревна 19.06.2021 23:01
medi-center.ru

Хочу сказать, спасибо, Медцентру. Столкнулись, к сожалению, и мы с мужем с ковидом. Однако получилось так, что с нашей поликлиники врачи не то чтобы не ехали на дом, там в принципе колцентр не работает, 25 телефонов и НИ ПО ОДНОМУ нам не ответили. А клиника Медицентр, работает и с пациентами по ДМС и ОМС!!! Не смотря, на всю загруженность с ковидными пациентами в нашем районе, в этом центре всегда ответят и отправят врача! И доктор ОБЯЗАТЕЛЬНО доедет! Ещё раз, спасибо, что в нашем районе есть такой центр, иначе я даже не представляю, как бы мы тут спасались в такой сложной ситуации.

Ильина Ю.И. 04.05.2021 15:08
medi-center.ru

Хочу поблагодарить замечательных докторов, которые выявили и вылечили открывшуюся у меня язву. В первую очередь врача-гастроэнтеролога Вещеву Марию Александровну. Хочется отметить внимательность к больному , заинтересованность в результате лечения и профессионализм. Соблюдая все рекомендации доктора я за 6 недель справилась со своей болячкой. Также большое спасибо доктору производившему ФГДС врачу-эндоскописту Трофимовой Л.Ш. Мне всегда трудно дается эта процедура, но доктор очень внимательно и аккуратно производила ее дважды, перед лечением и после окончания лечения. Большое им спасибо!

Хочу выразить огромную благодарность ,Агамурату Озармамедовичу Джораеву , в Мурино на Охтинской алее . У ребёнка был вывих локтевого сустава, все сделал очень быстро , вставил на место , нашёл подход к плачущему ребёнку !! Спасибо вашему центру, за отличных врачей !!!

Я лечусь в клинике на Охтинской аллее . Очень приятный , вежливый персонал , все чисто , аккуратно … врач у которого я лечусь , очень внимательный , «не разводит». Могу смело советовать эту клинику!!!

Ответы на вопросы раздела «Дерматология»

Я, именуемый(ая) в дальнейшем Субъект, разрешаю оператору OOО «Косметологическая поликлиника» № 1 далее Оператор, обработку своих персональных данных или данных доверителя (перечень персональных данных приведен в п. 3 настоящего Согласия) в информационной системе «Электронная запись в поликлинику» на следующих условиях:
1. Субъект дает согласие на обработку Оператором своих персональных данных или данных доверителя, то есть их сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), использование, обезличивание, блокирование, уничтожение (описание вышеуказанных способов обработки данных приведено в Федеральном законе «О персональных данных» от 27.07.2006 г. №152), а также право на передачу такой информации третьим лицам, в случаях предусмотренных федеральным и региональным законодательством.
2. Оператор имеет право обрабатывать (см. пункт 1 настоящего Согласия) данные Субъекта для получения Субъектом медицинских услуг в учреждении, а также для статистического мониторинга деятельности организации. Оператор обязан предоставить правоохранительным органам сведения о Субъекте только по официальному запросу в случаях, установленных законодательством.
3. Перечень персональных данных передаваемых Оператору на обработку:
— ФИО;
— Дата рождения;
— Серия и номер страхового медицинского полис;
— Адрес места жительства, номер телефона;
4. В соответствии с частью 4 статьи 14 Федерального закона от 27 июля 2006 г. N 152-ФЗ «О персональных данных» Субъект персональных данных по письменному запросу имеет право на получение информации, касающейся обработки его персональных данных.
5. Обработка персональных данных, не являющихся общедоступными персональными данными, прекращается при поступлении Оператору письменного заявления Субъекта о расторжении Согласия в соответствии с частью 5 статьи 21 Федерального закона от 27 июля 2006 г. N 152-ФЗ «О персональных данных».

Удаление мозолей лазером или жидким азотом г. Киев

Формирование мозолей происходит в ответ на механическое трение и раздражение. На ногах мозоли появляются обычно при ношении неудобной обуви. Это своеобразная защитная реакция кожного покрова на чрезмерное наружное раздражение. Мозоли могут образовываться и на руках, к примеру, при тяжелой или непривычной работе.

Косметологи и дерматологи Esthetic Clinic Киева рекомендуют удалять мозоли, поскольку со временем они все больше разрастаются и могут стать помехой для обуви и превратиться в значительный косметический дефект. Но лучше не делать это самостоятельно – ведь при удалении в домашних условиях легко занести в рану инфекцию. К тому же неправильное удаление мозоли может привести к еще большему ее разрастанию. Поэтому при наличии большой мозоли, причиняющей дискомфорт, лучше обратиться к профессионалу. Специалисты клиники ведут прием ежедневно, после предварительной записи.

Типы мозолей

Мозоль не относится к группе новообразований, но по сути, это доброкачественная гипертрофия кожных покровов в месте наибольшего раздражения. Все мозоли делятся на мокрые и сухие. Мокрая мозоль – это острый тип реакции на механический раздражитель. Она возникает чаще на увлажненной коже и представляет собой пузырь, наполненный лимфатической жидкостью или кровью, если при трении был поврежден кровеносный сосуд.

Сухие мозоли – не менее распространенный тип, но это, скорее, хроническая форма реакции на внешнее раздражение, которое имеет вид не трения, а давления. Именно поэтому сухие мозоли образуются на подошвах ног и прилегающих к ним участках стопы. Сухая мозоль часто не беспокоит человека и требует удаления только при чрезмерном разрастании.

Но нередко сухие мозоли вызывают выраженную болезненность. Такие мозоли, как правило, имеют так называемый стержень. Если рассмотреть мозоль в разрезе, то можно увидеть, что она имеет конусовидную форму. При этом вершина конуса направлена вглубь кожи, а основание находится у ее поверхности. Именно заостренная часть мозольного стержня вызывает раздражение нервных окончаний и боль. Естественно, что такую мозоль необходимо удалять.

Типы удаления мозолей

На сегодня существует немало способов удаления сухих мозолей. К ним отностятся и удаление классическим способом, т.е. элементарное ее иссечение с последующей обработкой и заживлением ранки. Незастарелые мозоли могут отпасть самостоятельно после распаривания. Но чаще самым эффективным средством избавления от мозолей становится прижигание, особенно если мозоль имеет небольшие размеры. Эту процедуру можно осуществить при помощи обычного электрокоагулятора с местным обезболиванием зоны кожного разрастания.

К современным типам удаления мозолей прижиганием относится лазерная коагуляция. Криодеструкция или воздействие жидким азотом – это, по сути, тоже прижигание, но под влиянием крайне низкой температуры.

Лазерное удаление сухих мозолей

Преимущества лазерного удаления заключаются в следующих факторах:

Это бесконтактный способ воздействия – риск инфицирования раны сводится к нулю;
Бескровность – лазерный луч, слой за слоем удаляя гипертрофированные ткани мозоли, одновременно прижигает мелкие капилляры окружающих тканей. Это еще один плюс в пользу отсутствия внешнего инфицирования.
Минимальное травмирование тканей – лазерный луч обладает высокой точностью наведения и фокусировки, поэтому воздействие осуществляется только в зоне мозольного разрастания.
Быстрое заживление после удаления – минимальная травматизация, отсутствие кровотечения и микробного заражения, конечно же, при условии правильного ухода за ранкой, приводят к быстрому восстановлению кожного покрова.

Удаление мозоли жидким азотом в Киеве

Воздействие жидким азотом возможно для удаления неглубокой мозоли. Это практически безболезненная процедура, однако, она уступает в точности наведения лазерной коагуляции. В остальном – бескровность, минимум инфицирования и раздражения окружающих тканей делают эту методику актуальным методом выбора для дерматологов и ортопедов.

Криодеструкцию проводят под давлением в течение 30 секунд. При этом клетки мозоли подвергаются отмиранию и отторжению. Заживление ранки после удаления происходит на удивление быстро, на коже не остается никаких следов – углублений, рубцов, пигментации и других проявлений.

Специалисты Esthetic Clinic Киева обязательно найдут оптимальный способ удаления мозолей у своих пациентов. Не стоит затягивать с устранением этого неприятного образования, которое со временем может перерасти в настоящую проблему. Раннее удаление мозоли обычно происходит без боли и не оставляет никаких последствий.

Видео: Удаление болезненных мозолей с помощью современного оборудования

Другие записи:
Самые актуальные темы:Украина, г. Киев.

RACGP — Оптимизация техники криохирургии

История вопроса

Криохирургия является эффективным, простым и недорогим методом лечения, широко используемым в общей практике и дерматологии. Чаще всего он используется при актиническом кератозе и бородавках; однако большое количество доброкачественных, предраковых и злокачественных кожных заболеваний также можно лечить.

Цель

Цель этой статьи — помочь читателям улучшить технику криохирургии.

Обсуждение

Нанесение криогенного агента (чаще всего жидкого азота) на кожу вызывает быстрое замораживание с последующим медленным оттаиванием.Это вызывает повреждение клеток, сосудистый застой и окклюзию, а также воспаление. Количество криогена, доставленного на кожу (доза), методика, продолжительность оттаивания и количество замороженных окружающих тканей зависят от области тела и типа поражения. Если клинический диагноз невозможен, рекомендуется либо биопсия кожи, либо направление к дерматологу. Мы настоятельно не рекомендуем слепое лечение невыявленных поражений кожи.

Криохирургия является эффективным, простым и недорогим методом лечения ряда распространенных поражений кожи.¹ Это признанный метод, который остается особенно популярным в общей практике для лечения актинических кератозов и бородавок. Лечение множественного актинического кератоза является одним из наиболее часто используемых номеров пунктов в Списке льгот Medicare (MBS) в общей практике, при этом количество процедур увеличилось с 247 515 до 643 622 в период с 1994 по 2012 год. ² Показатели лечения с Сообщается, что криохирургия актинического кератоза составляет от 86% до 99%. ^3,4 Таким образом, обзор показаний, периоперационных соображений и техники криохирургии является ценным инструментом для всех врачей общей практики (ВОП).

Ряд преимуществ криохирургии по сравнению с другими хирургическими методами лечения перечислены во вставке 1. Криохирургия не подходит, когда требуется гистологическое подтверждение или полное иссечение. Криохирургия может быть проблематичной для пациентов с III–V типами кожи по Фитцпатрику из-за поствоспалительной гиперпигментации и гипопигментации. Особая осторожность требуется также при лечении поражений кожи на покрытой волосами коже из-за риска алопеции.

Целью криохирургии является вызвать направленный некроз тканей путем охлаждения кожи и замораживания клеток.^5,6 Существует четкая доза-реакция между количеством криогена, нанесенного на поверхность кожи, и разрушением тканей. Степень разрушения ткани, в свою очередь, определяет скорость излечения, а также немедленную боль и время заживления после процедуры. Доза, доставляемая на кожу, определяется методом временного точечного замораживания, и это предсказывает исход терапевтического ответа и заболеваемость.

Механизм действия криохирургии включает передачу тепла между кожей и криогеном, повреждение клеток, сосудистый стаз и окклюзию, а также воспаление.⁷ Замораживание тканей приводит к ряду патологических изменений, включая образование кристаллов льда, нарушение целостности клеточных мембран, изменение рН ткани, нарушение гомеостатических функций и тепловой шок. Оттаивание тканей усиливает повреждение тканей из-за нарушения микроциркуляции сосудов и сосудистого стаза. Образование внутриклеточного льда максимизируется за счет быстрого охлаждения и медленного оттаивания нужной ткани. При повторяющихся циклах замораживания-оттаивания нижележащая строма обеспечивает основу для заживления раны и оптимизирует косметический результат.Острое воспаление в течение 24 часов после лечения дополнительно способствует гибели клеток и разрушению поражений. ⁷

Жидкий азот является наиболее часто используемым криогенным агентом. У него самая низкая температура кипения (–196°C) и наибольшая способность к замораживанию тканей среди доступных криогенов. Другие криогенные агенты, иногда используемые в клинической практике, включают закись азота, двуокись углерода и фторированные углеводороды. Эти агенты имеют более высокую температуру кипения, что делает их более подходящими для доброкачественных поражений, но непригодными для лечения рака кожи.Домашние средства, содержащие диметиловый эфир и пропан, могут подойти для лечения бородавок, но неэффективны для лечения предраковых и злокачественных поражений.

Жидкий азот чаще всего вводят с помощью аппарата закрытой системы, который позволяет непрерывно вводить жидкий азот в ткань-мишень. Инструменты, обычно используемые в дерматологии, включают портативные устройства с наконечником-распылителем или криозонд (контактная терапия). В зависимости от области тела также используются ватные аппликаторы и измельченный углекислый газ.Эти методы не позволяют точно определить дозировку. Оптимальная доза применяемого криогена, оптимальная техника применения, требуемая продолжительность охлаждения и количество окружающих тканей, которые следует заморозить, будут зависеть от характера обрабатываемого поражения и локализации поражения на теле.

Вставка 1. Преимущества криохирургии
Низкая стоимость Безопасно и просто Вариант лечения на любом участке тела Подходит для лечения многочисленных доброкачественных, предраковых и злокачественных поражений Подходит для офисных и амбулаторных условий.Нет необходимости в доступе в операционную или анестезии Подходит для кандидатов на хирургическое вмешательство, пожилых людей, беременных женщин или тех, кто не может или не хочет подвергаться общей анестезии В большинстве случаев требуется небольшой послеоперационный уход и отсутствие отпуска с работы или учебы

Показания и противопоказания

Существует ряд доброкачественных, предраковых и злокачественных поражений, которые можно лечить с помощью криохирургии.Для многих поражений, таких как вирусные бородавки и актинический кератоз, методом выбора является криохирургия. Криохирургия также используется в качестве лечения второй линии для пациентов, которые не хотят хирургического вмешательства, или у пациентов, у которых есть относительные противопоказания к хирургическому вмешательству, такие как аллергия на местную анестезию, коагулопатии с боязнью иглы или наличие кардиостимулятора или дефибриллятора, которые могут мешать электрокоагуляции. . Криохирургия также применяется при неоперабельных опухолях и паллиативном лечении.

Точная диагностика имеет решающее значение для определения дозы и количества необходимых повторных процедур.Если есть диагностическая неопределенность, пациента следует направить к дерматологу или выполнить биопсию кожи. Пункционная биопсия из центра поражения также предоставит информацию о толщине поражения. Если диагноз меланомы нельзя с уверенностью исключить при клиническом обследовании, требуется эксцизионная биопсия.

Более 50 типов доброкачественных поражений можно лечить с помощью криохирургии, некоторые из них перечислены в таблице 1. ⁷ Подходящие предраковые поражения и злокачественные новообразования in situ включают актинический кератоз, актинический хейлит, болезнь Боуэна и эритроплазию Кейра.Лечение злокачественного лентиго с помощью криохирургии не одобрено действующими рекомендациями по меланоме Австралии. Злокачественное лентиго на лице обычно принимают за актинический кератоз. Предлагаемый режим лечения ряда поражений в общей практике представлен в Таблице 2. ^7–11 Важно отметить, что обычная практика лечения актинического кератоза с помощью криохирургии приблизительно в течение одной-двух секунд неэффективна и, вероятно, приведет к дальнейшему лечению.

Криохирургия не подходит для поражений с плохо очерченными краями, диаметром поражения > 2 см, глубиной поражения > 3 мм или для поражений, которые связаны с нижележащими структурами.Рецидивирующие поражения и поражения крыльев носа, век, носогубной складки и предушной кожи лучше всего лечить с помощью хирургического иссечения, поскольку это позволяет провести гистологическое исследование краев и подтвердить полное гистологическое очищение.

Следует соблюдать осторожность при проведении косметических процедур с использованием криохирургии в общей практике. Плохие косметические результаты являются обычным явлением, и косметические процедуры следует предпринимать только после прохождения соответствующего обучения и с учетом медико-юридических последствий.

Относительные противопоказания к криохирургии связаны с выбором поражения и локализацией. Обычно лучше избегать лечения поражений в области бороды и поражений у пациентов с пигментированной кожей из-за риска необратимой алопеции и депигментации соответственно. Абсолютные противопоказания, как правило, связаны с преморбидными заболеваниями, включая агаммаглобулинемию, криоглобулинемию, дискразию крови неизвестного происхождения, непереносимость холода, холодовую крапивницу, болезнь Рейно, гангренозную пиодермию, коллагеновые и аутоиммунные заболевания.⁷ Глубоко инвазивные и агрессивные поражения следует направлять на консультацию и лечение к специалисту, а не на лечение с помощью криохирургии.

Таблица 1. Доброкачественные образования, поддающиеся криохирургическому лечению ⁷
Пигментные и меланоцитарные поражения
Мелазма – распространенное заболевание, поражающее лоб, щеки, нос и верхнюю губу. Чаще встречается у людей с хорошим загаром или с коричневой кожей.Таким образом, риск гипопигментации значителен, и неблагоприятные косметические результаты являются обычным явлением . Идиопатический каплевидный гипомеланоз Татуировки. Существуют гораздо более эффективные методы удаления татуировок. Направление к дерматологу перед лечением в общей практике сведет к минимуму вероятный риск рубцевания, связанный с криодеструкцией Простое лентиго Солнечное лентиго. Если эксцизионная биопсия не проводится, существует реальный риск того, что меланому in situ лечат ненадлежащим образом.Неблагоприятные исходы меланомы in situ являются отчетами .
Сосудистые поражения и невусы
Венозное озеро Вишневая ангиома Ангиокератома Мибелли Ангиокератома мошонки Паутинный невус Капиллярная гемангиома Кавернозная гемангиома Пиогенная гранулема (эти поражения требуют биопсии для исключения меланомы перед любой абляционной терапией)
Кисты, опухоли и невусы (кроме меланоцитарных невусов)
Киста акне Милия Миксоидная киста Сирингиома Трихоэпителиома Трихолеммальная киста Бирка для кожи Дерматофиброма Себорейный кератоз Сальная гиперплазия Аденома сальных желез
Прочие условия
Келоид Вульгарные угри и шрамы от угревой сыпи Ринофима Ксантелазма Очаговая алопеция

Таблица 2.Режим лечения кожных заболеваний в общей практике
Поражение	Техника	Время, количество циклов замораживания-оттаивания (ЦЗТ)	Маржа	Сеансы, интервал	Ожидаемый ответ
Вирусные бородавки	Плоские поражения: FTC Плоскость: метод открытого распыления (OS) – E-tip Подошвенный: насадка OS – B или C Филиформ/цифра: OS – игольчатый зонд Перед необходимо обрезать для удаления чрезмерного гиперкератоза	Плоский: 10 секунд, х 1 Плоскость: 3–5 секунд, х 1 Подошвенный: 10–20 секунд, х 1 Филиформ/цифра: 10 секунд, x 1 Рекальцитрантные поражения могут потребовать двойной FTC	1 мм	2 сеанса, 2 недели	45–85% Скорость ответа зависит от количества поражений, пользователя и техники
Паутинный невус	Криозонд (П)	10 секунд, х 1	1 мм	3 сеанса, 6 недель	Хорошо
Себорейный кератоз	OS, ватный щуп (D) или P	Ледообразование, х 1	1 мм	Обычно однократное лечение	Отлично
Бирка для кожи	ОС или щипцы	5–10 секунд, х 1	1 мм	Обычно однократное лечение	Отлично
Актинический кератоз	ОС	15 секунд, х 1	1 мм	Однократный сеанс, заживление в течение 10 дней	86–99%
Солнечное лентиго	ОС	5 секунд, х 1	1 мм	Один сеанс
Болезнь Боуэна	ОС	15–30 секунд, х 1	3 мм	Один сеанс	Отлично (до 98%)
Базально-клеточная карцинома	ОС (только соответствующие поражения)	30 секунд, х 2	5 мм
Дерматофиброма	П или ОС	20–30 секунд, х 1	2 мм	2 сеанса с интервалом 8 недель
Пиогенная гранулема	ОС	15 секунд, х 1	1 мм	Один сеанс
Вишневая ангиома	Р	10 секунд, х 1	1 мм	Один сеанс
*D, щуп; ОС, открытый спрей; P, криозонд*

Процедурные методы и варианты

Техника точечной заморозки по времени с открытым распылением

Наиболее часто используемая и наиболее надежная и воспроизводимая методика криохирургии — это методика точечной заморозки с открытым спреем.Он включает использование распылителя жидкого азота с насадкой-распылителем (Brymill Cryac Gun, Owen Galderma, Форт-Уэрт, Техас, США), выбор которого зависит от размера поражения. Насадка «D», как правило, подходит для большинства доброкачественных поражений. Пистолет-распылитель подает наиболее равномерный поток жидкого азота, когда канистра заполнена на две трети.

Тонкий спрей жидкого азота вводят под углом 90° и на расстоянии 1 см от поверхности кожи. Центр поражения распыляется до тех пор, пока поражение и желаемые края не будут затронуты.Замерзшая кожа сразу станет белой, так как образуется ледяной шар. По мере замерзания поражения границы могут стать трудными для определения. По этой причине полезно отметить желаемый боковой край перед замораживанием. Глубина промерзания будет примерно в 1,5 раза больше радиуса ледяного шара. ¹² Когда желаемый радиус достигнут, пропальпируйте ледяной шар, который образовался над поражением, чтобы убедиться, что все поражение замерзло. Когда клиницист удовлетворен степенью образования льда, продолжайте замораживание в течение дополнительного времени, соответствующего типу поражения.Важно отметить, что фактическое время замораживания начинается с момента образования удовлетворительного ледяного шара, а не с момента применения пистолета-распылителя. Ледяной шар может оставаться в течение многих секунд после того, как спусковой крючок отпущен, что означает, что общее время замораживания увеличивается. За счет контролируемого непрерывного распыления в центр поражения размер ледяного поля должен поддерживаться постоянным. Это достигается регулировкой давления на спусковой крючок. Если требуются повторные циклы замораживания-оттаивания, дайте пораженному месту полностью оттаять (обычно >60 секунд) перед повторным замораживанием.Чтобы убедиться, что ледяной комок отсутствует, пропальпируйте поражение между большим и указательным пальцами и подождите, пока исчезнет белая поверхность. ⁷

Существуют варианты метода открытого распыления для лечения крупных поражений или поражений, требующих поверхностного замораживания. Метод кисти включает в себя распыление всего поражения путем перемещения вверх и вниз по поражению. Спиральный метод включает распыление поражения от центра и во все более широких кругах до тех пор, пока не будет достигнута желаемая граница.⁷

Щуп с ватным наконечником

Щуп с ватным наконечником — в значительной степени устаревший метод использования жидкого азота. Он включает в себя погружение ватной палочки в чашку с жидким азотом перед нанесением ее непосредственно на поверхность кожи. Самодельная деревянная палочка с обернутым шерстяным наконечником содержит больше жидкого азота, чем расфасованные ватные палочки. Ватную палочку плотно прикладывают к поражению до тех пор, пока вокруг нее не образуется узкий ореол льда. ⁷ Давление на пораженный участок увеличивает площадь поверхности замороженной ткани и увеличивает падение температуры из-за опорожнения сосудистой сети.Рекомендуется декантировать небольшой объем жидкого азота из сосуда большего размера в индивидуальную полистироловую чашку для каждого пациента. Аденовирус и другие вирусы способны заразить целые хранилища жидкого азота, если не соблюдать строгую утилизацию. Техника щупа обычно используется для бородавок.

Криозонд

В методе криозонда используется плоский предварительно охлажденный металлический наконечник, прикрепленный к пистолету-распылителю с жидким азотом. Металлический наконечник плотно прилегает к поражению и отводит тепло от кожи, чтобы охладить поражение.Прямое давление на пораженный участок влияет на глубину и латеральное распространение обморожения. Учитывая этот механизм действия, время замораживания обычно больше (15–20 секунд для доброкачественных поражений и до нескольких минут для злокачественных новообразований). Можно использовать небольшое количество вазелина для облегчения контакта и возможности извлечения зонда при оттаивании. ⁷ При образовании льда зонд медленно отводят от кожи, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение окружающих тканей. Поражения, поддающиеся методу криозонда, включают венозные озера, гемангиомы, дерматофибромы, миксоидные кисты, ксантелазмы, а также базально- и плоскоклеточный рак.¹³

Устройство термопары

Использование устройства с термопарой, как правило, предназначено для лечения злокачественных новообразований, когда необходимо заморозить тот же объем ткани, который в противном случае был бы удален путем местного иссечения. Игла термопары представляет собой датчик температуры, прикрепленный к термометру, который имплантируется после местной анестезии целевого участка. Вся опухоль замораживается методом распыления или криозонда за один сеанс с использованием двойного цикла замораживания-оттаивания.Распыление жидкого азота обычно ограничивается конусом, который прикладывается к коже (метод ограниченного распыления). Жидкий азот распыляется в конус до тех пор, пока не будет достигнута температура от –50°C до –60°C. Рекомендуемое время заморозки составляет примерно 45 секунд для поражения размером 1 см. Этот метод обычно рекомендуется для практикующих специалистов, учитывая поражения высокого риска, поддающиеся этой форме лечения.

Соображения

Если поражение особенно толстое или приподнятое, его объем может препятствовать продвижению ледяного кома и ограничивать вовлечение соответствующей глубины.Полезно уменьшить объем с помощью кюретки, ножниц или электрохирургии. Перед криодеструкцией необходимо обеспечить гемостаз.

Большие поражения следует лечить с перекрытием краев лечения. Это обеспечивает равномерное лечение всего поражения и не влияет на заживление раны или косметический результат. Некоторые поражения можно лечить сегментами в тот же день или во время последующих посещений.

Инъекция местного анестетика ниже поражения может быть использована для приподнятия поражения от подлежащих тканей или поверхностных сосудисто-нервных структур.Это может быть особенно полезно при бородавках и актиническом кератозе на пальцах или голове и шее.

Послеоперационный уход и консультации пациентов

Послеоперационный уход зависит от типа поражения, локализации, глубины и количества циклов замораживания. Большинство доброкачественных поражений, леченных в общей практике, требуют минимального послеоперационного ухода. Как правило, пациенты могут вернуться к работе и физическим упражнениям в день процедуры.

Пациентов следует предупредить, что неглубокий струп образуется и самопроизвольно отпадает в течение 10 дней.Под струпом может образоваться водянистый экссудат или грануляционная ткань. Это можно лечить путем промывания водой с мылом, обработки раны кюретажем или применения мази с антибиотиком. Информирование пациентов о формировании «пузырей с кровью» и признаках локализованной инфекции важно для обеспечения надлежащего представления. У пациентов с плохим кровообращением на голенях и голенях может наблюдаться длительное заживление ран. К криохирургии в этих областях следует подходить с осторожностью из-за возможности образования незаживающей язвы.

Осложнения

Криохирургия связана с рядом потенциальных краткосрочных и долгосрочных осложнений (Таблица 3). Осложнения связаны с неожиданными исходами (например, кровотечением, инфекцией), плохим косметическим результатом (например, образование гипертрофического рубца) или в результате чрезмерной реакции на замораживание (например, гипопигментация). Жгучая боль ощущается во время замораживания, а пульсирующая боль, которая обычно более сильная, возникает во время фазы оттаивания. Боль особенно выражена в околоногтевых областях и волосистой части головы.⁷

Пигментные изменения являются распространенными косметическими осложнениями после криохирургии. Временная гиперпигментация в результате чувствительности меланоцитов к низким температурам часто встречается у людей с кожей оливкового цвета. Эти изменения являются длительными, но обычно временными (от двух до четырех месяцев). Гипопигментация возникает при более длительном времени замораживания (например, 20–30 секунд) и является результатом повышенной чувствительности меланоцитов к замораживанию. Рекомендации пациентам соблюдать строгую защиту от солнца снижают риск временной гиперпигментации.Потеря пигмента может быть необратимым осложнением криохирургии и обычно происходит в результате применения больших доз жидкого азота. Чаще встречается на лице. Следует соблюдать осторожность у пациентов с темной кожей, и перед лечением следует наложить тестовый пластырь. Алопеция также обычно носит постоянный характер.

Рубцевание и контрактура ран являются осложнениями при применении доз жидкого азота в течение >30 секунд. Нижележащие фибробласты и коллагеновые волокна морозоустойчивы до 30 секунд, что приводит к сохранению структуры волокнистого матрикса.¹⁴ Коллаген также является криоустойчивым, что означает, что уши и нос могут получать циклы продолжительностью до 30 секунд без деформации формы. ¹⁵

Повреждение нерва часто встречается при замораживании вышележащих поверхностных нервов, включая стороны пальцев, заушный или малоберцовый нерв. Степень невропатии зависит от продолжительности времени замораживания. Нарушаются легкое прикосновение, температура и болевые ощущения, и полное восстановление (если вообще восстановление) может занять до 18 месяцев.Пациенты должны быть проинформированы об этих побочных эффектах при лечении чувствительных областей.

Таблица 3. Непосредственные, ближайшие и отдаленные осложнения криохирургии
Темы	Вопросы
Непосредственные осложнения	Боль Кровотечение Головная боль Обморок Отек/образование пузырей
Краткосрочные осложнения	Инфекция Кровотечение и образование «кровяных пузырей» Пиогенная гранулема (редко) Длительное заживление ран (в зонах с плохим кровообращением)
Отдаленные осложнения	Повреждение нерва Пигментные изменения Гипертрофические рубцы Постоянная дистрофия ногтей Рецидив поражения Алопеция Эктропион Выемка века, красной каймы или уха

Авторы

Уильям К. Крэнвелл MBBS (с отличием), BMedSc (с отличием), MPH&TM, врач-резидент, Королевская больница Мельбурна, Парквилл, Виктория; Научный сотрудник по клиническим исследованиям, Sinclair Dermatology, Восточный Мельбурн, Вик

Родни Синклер MBBS, FACD, MD, профессор медицинского факультета Мельбурнского университета, Парквилл, Вик; директор Sinclair Dermatology, Восточный Мельбурн, Вик; Директор по дерматологии, Epworth Dermatology, Ричмонд, Виктория[email protected]

Конкурирующие интересы: Нет.

Происхождение и экспертная оценка: заказ, внешняя экспертная оценка.

Подиатр семьи Hermiston лечит подошвенные бородавки

Подошвенные бородавки — это безвредные незлокачественные новообразования, которые образуются на подошвах стоп. Они вызваны вирусом и не представляют серьезной проблемы для здоровья, но могут быть неприятными, а иногда и болезненными. Подошвенные бородавки выглядят как твердые пятна или бугорки на коже и часто имеют небольшой черный центр.Со временем они могут пройти самостоятельно, но часто требуется лечение, чтобы избавиться от бородавки. Если лечение в домашних условиях не помогает удалить бородавки, обратитесь к ортопеду для профессионального лечения подошвенных бородавок.

Причины подошвенных бородавок

Подошвенная бородавка вызывается микроскопическим вирусом, называемым ВПЧ или вирусом папилломы человека. Этот вирус может попасть в организм через порезы или повреждения кожи на ступнях. Обычно вирус подхватывают, подвергая подошвы ног воздействию теплой и влажной среды, например, в общественных местах вокруг бассейнов, душевых, тренажерных залов или раздевалок.У людей всех возрастов могут развиться подошвенные бородавки. В группу наибольшего риска входят:

Дети
Подростки
Пожилой
Те, у кого в прошлом были подошвенные бородавки
Людям с ослабленной иммунной системой

Некоторые люди более восприимчивы к бородавкам, чем другие. Не у всех, кто вступает в контакт с ВПЧ, появляются бородавки. Вы можете заразиться бородавкой, поделившись личными вещами с другим человеком, у которого есть ВПЧ или бородавка.Вы можете заразить себя, прикоснувшись к бородавке на ноге, а затем к другой части тела. Подошвенные бородавки могут расти медленно и могут находиться под кожей в течение нескольких месяцев, прежде чем станут заметными.

Общие симптомы подошвенной бородавки

Если вы заметили шишкообразный нарост на подошве стопы, это может быть подошвенная бородавка. Бородавки могут быть разных форм и размеров. Есть несколько общих симптомов подошвенных бородавок, таких как:

Нарост с грубой зернистой текстурой
Утолщение кожи над наростом, образующим мозоль
Черное точечное пятно в центре нароста, которое часто ошибочно называют семенем бородавки, но на самом деле это небольшой закупоренный кровеносный сосуд в середине бородавки
Боль при ходьбе, стоянии или надавливании из-за того, что бородавка врастает внутрь нижней части стопы

Расположение подошвенных бородавок может быть разным.Бородавки могут образовываться у основания пальцев, передней части стопы или пятки. Они обычно находятся в тех областях стопы, на которые приходится наибольшая нагрузка. Бородавки могут образовываться как единичный нарост или расти в виде кластера.

Диагностика подошвенных бородавок

Если у вас есть симптомы подошвенной бородавки, которые не проходят, или вы не уверены, что это может быть за рост, проконсультируйтесь с ортопедом для оценки. Диагностика подошвенных бородавок осуществляется путем физического осмотра, и ваш ортопед может сказать, является ли рост бородавкой, только по ее внешнему виду.Если рост выглядит подозрительно, может быть сделана биопсия, чтобы исключить другие возможные состояния.

Людям с ослабленной иммунной системой, диабетом или другими серьезными заболеваниями следует проконсультироваться с ортопедом, прежде чем пробовать варианты домашнего лечения. Если вы заметили какие-либо из следующих симптомов подошвенной бородавки, немедленно обратитесь к ортопеду:

Кровотечение
Изменения внешнего вида или цвета
Рост становится красным или горячим на ощупь, что указывает на инфекцию
Боль при повседневной деятельности

Как предотвратить появление подошвенных бородавок

Вы можете принять определенные меры предосторожности, чтобы снизить риск развития подошвенных бородавок или предотвратить распространение существующей бородавки на другие участки тела.Мы рекомендуем принять следующие меры предосторожности:

Старайтесь избегать контакта с бородавками и мойте руки, если прикоснулись к ним.
Не ковыряйте бородавки, иначе они могут распространиться.
Ежедневно мойте ноги с мылом и обязательно вытирайте их после.
Ежедневно меняйте обувь и носки и чередуйте обувь, чтобы дать им время проветриться между ношениями.
Не ходите босиком возле бассейнов, в раздевалках или в общественных душевых. Защитите свои ноги, надев тапочки для душа или сандалии в этих местах.
Не используйте на коже или ногтях инструменты, которыми вы лечили бородавки. Это включает в себя пемзу или кусачки для ногтей.
Если вы делаете педикюр, убедитесь, что инструменты должным образом продезинфицированы и очищены, прежде чем использовать их на ногах.
Если у вас есть бородавка, никогда не брейте и не стригите ее, иначе это может привести к ее распространению.

Варианты лечения подошвенных бородавок

Варианты лечения зависят от того, болезненны ли бородавки или они распространяются.Бородавки часто могут исчезнуть сами по себе. Некоторых людей может беспокоить появление бородавок, и они нуждаются в лечении. Продукты, отпускаемые без рецепта, такие как гели, лосьоны или мази, содержащие салициловую кислоту, доступны и могут быть приобретены в розничных магазинах, таких как аптеки, но они часто неэффективны для удаления бородавок.

Существует множество вариантов лечения подошвенных бородавок, которые ортопед может порекомендовать, например:

Замораживание бородавки с использованием криотерапии жидким азотом для разрушения ткани
Нанесение рецептурного препарата под названием кантаридин на бородавку с последующим наложением на нее повязки
Введение лекарства непосредственно в бородавку
Хирургическое удаление бородавки с использованием таких методов, как кюретаж, электрохирургия или лазерная хирургия

Часто лечение бородавки не может полностью уничтожить бородавку, и она может рецидивировать или распространиться на другую часть стопы.Это связано с тем, что вирус, вызвавший бородавку, все еще присутствует в организме. Бородавки трудно поддаются лечению, и может потребоваться более одного лечения.

Запишитесь на прием сегодня

Вам не нужно жить с хроническими подошвенными бородавками, и вам не нужно продолжать тратить деньги на безрецептурные средства, которые не работают. Запишитесь на прием к нашему ортопеду, чтобы получить постоянное решение этой надоедливой проблемы. Заполните нашу контактную форму или позвоните в наш офис в Хермистоне по телефону 541-567-8750.

границ | Pluronic F-68 улучшает пролиферацию каллуса у неподатливого сорта риса за счет усиленного метаболизма углерода и азота и поглощения питательных веществ

Введение

Рис является одним из основных продуктов питания, которым питается более половины населения мира (Hadiarto and Tran, 2011). В азиатских странах рис обеспечивает почти половину общего количества углеводов в рационе и 50–80% дневного потребления калорий (Khush, 2005). Увеличение производства риса должно стать приоритетом, чтобы поддерживать постоянно растущее население мира (Sen et al., 2020). Благодаря развитию современной биотехнологии генетические манипуляции могут служить альтернативным решением для удовлетворения растущих потребностей производства риса (Low et al., 2018). Тем не менее, генетические манипуляции с сортами риса indica остаются сложной задачей. Это связано с тем, что сорта риса indica обладают общими рекальцитрантными свойствами в отношении реакций регенерации in vitro . Например, сорта риса indica страдают плохой пролиферацией каллуса, низкой эффективностью регенерации, длительным периодом регенерации и низкой скоростью трансформации (Sah et al., 2014). Следовательно, чтобы улучшить реакцию in vitro сорта риса indica , требуется оптимизация среды для выращивания растений.

Добавки являются ключевыми компонентами в улучшении реакции in vitro сортов риса indica (Abiri et al., 2017; Kok et al., 2018). Некоторые из широко используемых добавок для роста в культурах растительных тканей включают плюроник F-68 (PF-68), лигносульфонат, нитрат серебра, кремний, кокос и гибберелловую кислоту (Biswas and Mandal, 2007; He et al., 2013; Йылдырым и Туркер, 2014 г.; Иршад и др., 2018; Ван Абдулла и др., 2020). PF-68 представляет собой неионогенное сополимерное поверхностно-активное вещество, которое использовалось в качестве добавки как в культурах животных, так и в культурах растений (Meier et al., 1999; Barbulescu et al., 2011). PF-68 широко используется в культуре суспензий клеток животных для защиты и восстановления поврежденных клеток от постоянного промывания и перемешивания (Meier et al., 1999). Дальнейшее исследование применения PF-68 в дрожжевых клетках показало, что PF-68 способен взаимодействовать с клеточной поверхностью, увеличивая проницаемость клеточной мембраны за счет образования недолговечных трансмембранных пор (King et al., 1991; Чо и др., 2007). Благодаря повышенной проницаемости мембран в клеточной культуре стимулировались поглощение питательных веществ и рост клеток (Shelat et al., 2013). Однако результат этого взаимодействия зависит от концентрации. При высокой концентрации PF-68 способен нарушать нормальную архитектуру липидного двойного слоя, что приводит к лизису клеток (Cho et al., 2007).

Как и в случае с культурой клеток животных, было обнаружено, что применение PF-68 увеличивает поглощение питательных веществ и рост растений в культуре тканей растений.В дополнение к этому было показано, что применение PF-68 увеличивает высвобождение антрахинона в среду в суспензионных культурах Morindacitrifolia , что свидетельствует об увеличении проницаемости мембран или клеточных стенок Morindacitrifolia (Bassetti et al., 1995). . В аналогичном исследовании было продемонстрировано, что секреция колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов человека стимулировалась при добавлении PF-68 в культуру суспензии клеток трансгенного Nicotiana tabacum (Cho et al., 2007). Кроме того, применение ПФ-68 усиливало регенерацию побегов у Citrus sinensis (Curtis, Mirkov, 2012), Pyrus communis (Dashti et al., 2012), Ricinus communis (Kulathuran and Narayanasamy, 2015). ) и Abelmoschus esculentus (Irshad et al., 2018). Примечательно, что PF-68 продемонстрировал улучшение роста корней, каллюса и протопласта Solanum dulcamara (Kumar et al., 1992), регенерацию побегов рекальцитрантных эмбрионов Brassica napus (Barbulescu et al., 2011) и пролиферацию каллуса у неподатливого риса indica (Kok et al., 2020). Это означает, что PF-68 может быть хорошим кандидатом для улучшения роста клеток растений и регенерации рекальцитрантных сортов.

Более раннее исследование, проведенное Kok et al. (2020) при применении PF-68 показали успешное увеличение скорости пролиферации каллусов и количества каллусов с корневидной структурой у сорта риса MR 219 indica . К сожалению, основные механизмы стимулирования роста PF-68 остаются в значительной степени неизвестными.Следовательно, чтобы закрыть этот пробел и максимально использовать PF-68 в качестве стимулятора роста, крайне важно понять механизм его действия. Поэтому настоящее исследование было направлено на изучение механизма действия PF-68 в усилении роста сорта риса MR 219 indica .

Материалы и методы

Растительные материалы

Сорт

MR 219 был выбран в качестве модели рекальцитрантного сорта риса в этом исследовании. Семена рекальцитрантного малазийского сорта MR 219, используемые в этом исследовании, были получены из Малазийского института сельскохозяйственных исследований и разработок (MARDI), Себеранг Прай, Пенанг, Малайзия.

Плюроник F-68

Аналитическая чистота PF-68 (10%), используемая в этом исследовании, была приобретена у компании Thermo Fisher Scientific, США.

Стерилизация семян и условия роста

Поверхностная стерилизация семян проводилась в соответствии с ранее описанным протоколом Lim and Lai (2017) с небольшими изменениями. Во-первых, зрелые семена очищали от шелухи и стерилизовали поверхность, используя 70% (об./об.) этанол в течение 1 мин, а затем 50% (об./об.) Clorox, содержащий 6% гипохлорита натрия, в течение 30 мин.Затем семена промывали дистиллированной водой для удаления оставшихся остатков и сушили на воздухе на стерилизованной фильтровальной бумаге. Затем стерилизованные семена переносили на предварительно установленную среду для индукции каллюса, содержащую базальную среду Гамборга В5 (Gamborg et al., 1968), с добавлением 10 г/л мальтозы, 0,1 г/л L-глутамина, 0,1 г/л /л L-аспарагина, 0,1 г/л L-аргинина, 10 мг/л 1-нафталинуксусной кислоты и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, pH 5,8 для 2-недельной инкубации в темноте при 25 ± 2°C (Лоу и др., 2019). Затем каллусы, полученные из семян, переносили на среду Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige and Skoog, 1962), содержащую 30 г/л сахарозы без регуляторов роста растений (MSO), с добавлением PF-68 (0,04 и 0,10% (масса/объем) на 2 недели инкубации в темноте при 25 ± 2°С. Каллус, культивированный на среде MS без добавки PF-68, использовали в качестве экспериментального контроля. Морфологические изменения каллуса регистрировали в конце инкубационного периода. Измеряли сырую массу (СМ) каллуса и регистрировали его постоянную сухую массу (СС) после сушки при 50°С в сушильном шкафу в течение 5 сут.Измерение проводили в трехкратной повторности с тремя биологическими повторами.

Общее содержание растворимого сахара

Общий растворимый сахар измеряли фенол-сернокислотным методом (Terzi et al., 2014). Приблизительно 0,25 г каллусов измельчали в порошок с помощью жидкого азота. Затем порошкообразные каллусы гомогенизировали в 3 мл 80% (об./об.) этанола и центрифугировали при 880 × г в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость смешивали с 1 мл 5% (об./об.) фенола и 5 мл концентрированной серной кислоты на 1 мл надосадочной жидкости.Поглощение образцов измеряли при 565 нм с помощью спектрофотометра (Implen GmbH, Германия). Соответствующую концентрацию определяли, используя в качестве стандарта раствор глюкозы.

Общее содержание белка

Содержание белка в каллюсе определяли с помощью анализа Брэдфорда (Kruger, 1994). Приблизительно 0,1 г каллусов растирали в порошок в жидком азоте и смешивали с 900 мкл 50 мМ бикарбоната аммония и 100 мкл 50 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ).Затем смесь встряхивали, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали в соответствии с Yang et al. (2019). Осаждение ацетоном проводили согласно Jiang et al. (2004). Белковый осадок растворяли в соотношении 9:1 50 мМ бикарбоната аммония к 50 мМ PMSF. Содержание белка в экстракте определяли при 595 нм (Kruger, 1994). Соответствующую концентрацию определяли, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Активность глутаматсинтазы

Активность глутаматсинтазы (GOGAT) измеряли по методу, описанному Ertani et al.(2011). Следующие стадии проводили при 4°C. Для выделения GOGAT-активности ~0,2 г образцов растирали в порошок в присутствии жидкого азота. Порошкообразные каллусы затем гомогенизировали с 2 мл экстракционного раствора, содержащего 100 мМ Hepes-NaOH при pH 7,5, 5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ дитиотреитола. Экстракт фильтруют через два слоя муслиновой ткани. После центрифугирования при 20 000 × g при 4°C в течение 15 мин 100 мкл супернатанта гомогенизировали с 1 мл раствора смеси, содержащей 25 мМ Hepes-NaOH при pH 7.5, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ α-кетоглутаровой кислоты, 0,1 мМ НАДН и 1 мМ Na ₂ ЭДТА. Активность GOGAT измеряли спектрофотометрически, контролируя окисление НАДН при 340 нм. Активность фермента выражали в мкмоль 90 288 -1 90 289 г 90 288 -1 90 289 FW, представляя количество фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль НАДН мин 90 288 -1 90 289 .

Активность фенилпропаноид-аммиачной лиазы

Активность фенилпропаноидаммонийной лиазы (PAL) измеряли в соответствии с протоколом, описанным Wang et al.(2016) с небольшими изменениями. Приблизительно 0,2 г каллусов образца измельчали в порошок в жидком азоте. Затем порошкообразные каллусы смешивали с 2 мл экстракционного буфера, состоящего из 50 мМ Tris-HCl буфера с pH 8,5, 5 мМ Na ₂ ЭДТА, 15 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ PMSF и 0,15% (мас./об.) поливинилпирролидина. Экстракт центрифугировали при 12 000 × g при 4°С в течение 20 мин. Двадцать микролитров экстракта использовали для измерения содержания белков с использованием анализа Бредфорда, а оставшийся экстракт использовали для определения активности PAL.Всего 500 мкл экстракта смешивали с 3 мл реакционного буферного раствора, состоящего из 50 мМ Tris-HCl буфера (рН 8,5) и 12 мМ L-фениаланина. Затем смесь инкубировали при 30°С в течение часа. Активность PAL измеряли при 290 нм. Активность PAL рассчитывали на основе стандартной кривой PAL, построенной коричной кислотой, где одна единица PAL дезаминирует L-фенилаланин до транс-коричной кислоты. Удельную активность PAL рассчитывали по активности PAL при 290 нм (U), деленной на концентрацию белка PAL (мкг) и выражали как U/мкг белка.

Малоновый диальдегид Содержание

Уровни перекисного окисления липидов в образцах определяли с помощью анализа малонового диальдегида (МДА). МДА является продуктом перекисного окисления липидов, количество которого можно определить в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Heath and Packer, 1968). Приблизительно 0,2 г образцов измельчали в порошок с использованием жидкого азота, а затем гомогенизировали с 2 мл охлажденного льдом фосфатно-солевого буфера (PBS). Затем смесь центрифугировали при 12 000 × g в течение 15 мин при 4°С.Двести микролитров полученного супернатанта смешивали с 800 мкл PBS, 25 мкл бутилгидрокситолуола (8,8 мг/мл) и 500 мкл 50% (масса/объем) трихлоруксусной кислоты. Смесь оставляли на 2 ч на льду. Затем смеси центрифугировали при 12 000 × g в течение 15 мин при 25°С. Затем один миллилитр образца смешивали с 75 мкл 100 мМ ЭДТА и 250 мкл 50 мМ тиобарбитуровой кислоты. Смесь кипятили 15 мин и оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Содержание МДА в образце определяли при 532 и 600 нм.Соответствующую концентрацию определяли с использованием тетраметоксипропана в качестве стандарта.

Активность пероксидазы

Активность пероксидазы определяли, как описано Agostini et al. (1997) с изменениями. Приблизительно 2 г образцов измельчали в порошок с использованием жидкого азота, а затем гомогенизировали с 0,8 мл экстракционного буфера, содержащего 10 мМ буфера ацетата натрия/уксусной кислоты при рН 4,0 и 1 М хлорида натрия. После центрифугирования при 5000 × г в течение 5 мин при 4°С экстракт использовали для определения содержания белка с помощью анализа Бредфорда, а оставшийся экстракт использовали для определения пероксидазной активности.В общей сложности 2 мкл экстракта смешивали с 1 мл реакционной смеси, содержащей 630 мкМ о-дианизидина, 500 мкМ H ₂ O ₂ и 100 мМ буфера ацетата натрия/уксусной кислоты при рН 5.3. Активность пероксидазы определяли сразу, измеряя оптическую плотность при 470 нм. Пероксидазную активность измеряли по количеству фермента, образующего 1 мкмоль продукта в минуту, образующегося при окислении о-дианизидина.

Активность эстеразы

определяли с помощью простого флуорометрического метода, описанного Watanabe and Lam (2008).В качестве флуоресцентного индикатора жизнеспособности клеток использовали диацетат флуоресцеина (FDA) посредством активности эндогенной эстеразы. Приблизительно 0,2 г образцов были заземлены жидким азотом. Затем порошкообразные каллусы окрашивали реакционной смесью, содержащей 2,5 мкг/мл FDA в PBS. Смесь оставляли инкубироваться на 10 мин при 25°С. Затем смесь промывали три раза, используя реакционную смесь, содержащую 2,5 мкг/мл FDA в PBS. Для количественного определения эндогенной эстеразной активности полученные супернатанты использовали в качестве образцов для прямого измерения эстеразной активности in vitro с помощью флуоресцентного микропланшет-ридера (TECAN Infinite 200, Швейцария).Величину флуоресценции суспензии определяли при длине волны возбуждения 440 нм и длине волны испускания 550 нм.

Анализ содержания питательных ионов каллуса методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС)

При исследовании содержания питательных ионов образец каллуса сушили в печи при 70°C в течение 5 дней. Образец обрабатывали, как описано ранее Karpiuk et al. (2016) с небольшими изменениями. Высушенный образец гомогенизировали в мелкий порошок и хранили в эксикаторе до последующего анализа.Массу 1 г измельченного образца взвешивали, переносили в кварцевый тигель и сжигали в муфельной печи. Температуру в муфельной печи постепенно повышали от комнатной до 530–550°С в течение 5 ч. Затем охлажденный остаток растворяли в 6 мл 6-М HCl в течение часа. Затем полученные растворы фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman в мерную колбу. Затем отфильтрованный раствор переносили в прибор ААС (Thermo Fisher Scientific, США) для измерения содержания питательных веществ в сравнении со стандартами.Условия эксплуатации, использованные для работы прибора ААС, соответствовали рекомендациям производителя.

Протеомный анализ

При протеомном анализе образцы растений измельчали в мелкий порошок с помощью жидкого азота и гомогенизировали в соотношении 9:1, состоящем из 50 мМ бикарбоната аммония и 50 мМ PMSF. Затем смесь встряхивали, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали в соответствии с Yang et al. (2019), и были собраны солюбилизированные белки. Обессоливание проводили с использованием метода осаждения ацетоном (Jiang et al., 2004). Белковый осадок растворяли в соотношении 9:1 (50 мМ бикарбоната аммония к 50 мМ PMSF). Содержание белка в экстракте определяли при 595 нм с помощью анализа Бредфорда (Kruger, 1994). К образцу белка добавляли дитиотреитол до конечной концентрации 10 мМ и затем инкубировали на орбитальном шейкере при 25 ± 2°С в течение 30 мин. Затем в смесь добавляли йодацетамид до конечной концентрации 10 мМ и смесь инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.В белковую смесь добавляли трипсин в соотношении трипсина к белку 1:20 (вес/вес) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Образец высушивали в вакуумном концентраторе SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, США). После этого высушенный образец растворяли в 200 мкл воды для молекулярной биологии и сушили в Speedvac. Этот шаг был повторен дважды. Затем образец хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

Наножидкостную хроматографию

проводили в тандемной масс-спектрометрии (нано ЖХ-МС/МС) на приборе Dionex 3,000 Ultimate RSLCnano (Thermo Fisher Scientific, США).Аликвоту образца расщепленных белков объемом 2 мкл вводили в колонку EASY-Spray Acclaim PepMapTM C18 100 (A0, размер частиц 2 мкм, внутренний диаметр 50 мкм × 15 см) при 35°C. Процесс элюирования образца выполняли аналогично тому, как описано Yang et al. (2019). Элюент из ЖХ вводили непосредственно в масс-спектрометр (Orbitrap Fusion – Thermo Fisher Scientific, США). Прибор работал в информационно-зависимом режиме. Спектры полного сканирования были собраны с помощью Orbitrap MS (OTMS1) с использованием параметров, определенных в предыдущем исследовании (Yang et al., 2019). Только предшественники с заданным моноизотопным m/z и зарядовым состоянием от 2 до 7 были дополнительно проанализированы на MS2. Все прекурсоры были отфильтрованы с использованием 20-секундного окна динамического исключения и порога интенсивности 5000. Прекурсоры были фрагментированы диссоциацией, индуцированной столкновением (CID), и диссоциацией столкновений с более высокой энергией (HCD) при нормализованной энергии столкновения 30 и 28%. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Thermo Scientific ^TM Proteome Discoverer ^TM 2.1.

ПЦР-анализ в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из порошкообразных каллусов, инкубировали в трех обработках (контроль, 0,04%, 0,10% PF-68) с использованием мини-набора RNeasy Plant (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом, описанным в Lai and Masatsugu (2013). кДНК первой цепи синтезировали из 1 мкг выделенной тотальной РНК с использованием набора QuantiNova Reverse Transcription Kit (Qiagen, Германия). Праймеры были разработаны (дополнительная таблица 1) с использованием Primer-Blast из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и синтезированы компанией Integrated DNA Technologies (IDT, США).ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы aBio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США) с ПЦР QuantiNova SYBR Green (Qiagen, Германия) по протоколу, описанному Lai et al. (2011). Используемые условия реакции ПЦР были следующими: 95°С в течение 30 с, затем 40 циклов 95°С в течение 5 с и 60°С в течение 5 с. Для каждого образца проводили три биологические повторности и три технические повторности. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.1. Относительные уровни экспрессии (2 ^{-Δ ΔCT} ) рассчитывали по методу Ливака (Livak and Schmittgen, 2001).Эталонными генами, использованными в этом исследовании, были рис , циклофилин ( OsCYC ) и убиквитин 5 ( OsUBQ5 ).

Статистический анализ

Все представленные данные представляли собой среднее ± среднее значение стандартной ошибки (SEM) для трех биологических повторов с тремя техническими повторами. Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа на значимом уровне p <0,05 между каждым лечением с использованием статистического пакета для социальных наук версии 20 (IBM Corp., Армонк, США).

Результаты

Рост-стимулирующая реакция PF-68 без присутствия растительного гормона

Более раннее исследование PF-68 при пролиферации мозолей показало, что оптимальная концентрация PF-68 (0,04%) значительно усиливает пролиферацию мозолей MR 219 (Kok et al., 2020). Между тем было показано, что высокая концентрация PF-68 (0,10%) вызывает стрессовую реакцию (Kok et al., 2020). В этом исследовании растительные гормоны были удалены из среды для пролиферации каллуса, чтобы исследовать механизм, управляющий стимулирующей рост реакцией PF-68 в качестве растительной добавки без вмешательства растительных гормонов.Основываясь на результатах, показанных на рисунке 1A, применение 0,04% PF-68 значительно усиливало пролиферацию каллюса MR 219 в среде MSO на 68,1% и 15,02% в FW и DW, соответственно.

Рисунок 1 . Данные получены для каллусов, пролиферирующих на среде Мурасиге и Скуга (MS) с добавлением различных концентраций PF-68 без растительных гормонов (MSO) в течение 3 недель. (A) Средняя масса в сыром и сухом виде, зарегистрированная для 3-недельных каллусов; (Б) Морфология каллуса на МСО (контроль), МСО +0.04% и МСО +0,10% ПФ-68; (C) контрольный каллюс на 3 неделе; (D) каллюс на MSO +0,04% PF-68 на 3-й неделе; (E) каллюс на MSO +0,10% PF-68 на 3-й неделе; (F) Каллюс с корневидной структурой на 3-й неделе. Данные показывают среднее из трех биологических повторов. Звездочки (*) указывают на статистически значимую разницу при p <0,05 в тесте Даннета. Шкала баров соответствует 0,5 см. Столбики погрешностей представляют среднее стандартное значение ошибки.

Большинство каллусов (рис. 1В), культивируемых как на контроле, так и на PF-68, были компактными, сухими и желтовато-белыми (рис. 1С, D).По мере увеличения концентрации PF-68 наблюдалось уменьшение количества желтовато-белых каллусов (рис. 1В). Наибольшее количество желтовато-белых каллусов (80%) было зарегистрировано в MSO (контроль) по сравнению с 75% при добавлении 0,04% PF-68 и 65,00% при добавлении 0,10% PF-68 (рис. 1B). Также было отмечено увеличение количества коричневых (рис. 1E) и черных (рис. 1F) каллусов. Наибольшее количество коричневых и черных каллусов, зарегистрированных в 0,10% PF-68, составило 26,67 и 8,33% соответственно (рис. 1В).Кроме того, применение PF-68 увеличило количество мозолей с корневидной структурой (рис. 1F). Добавка с 0,04% PF-68 зафиксировала наибольшее количество на уровне 76,67% (рис. 1B).

Биохимические оценки PF-68 при оптимальных и высоких концентрациях

Для дальнейшего изучения основного механизма стимуляции роста PF-68 при пролиферации мозолей были проведены биохимические оценки MSO, 0,04% PF-68 и 0,10% PF-68. В обоих каллюсах, выращенных на 0, обнаружено значительное увеличение общего содержания сахаров.04% PF-68 (0,81 мг/мл) и 0,10% PF-68 (0,75 мг/мл) по сравнению с контролем (0,67 мг/мл) (рис. 2А). Аналогичным образом, в каллусе, выращенном на 0,04% ПФ-68 (0,58 мг/мл) и 0,10% ПФ-68 (0,49 мг/мл), было зафиксировано значительное увеличение содержания белков по сравнению с контролем (0,45 мг/мл) (рис. 2Б). Увеличение содержания белков в целом соответствовало увеличению активности GOGAT, зарегистрированному в каллусе, выращенном на 0,04% PF-68 с 0,48 мкмоль/г белка по сравнению с контрольным 0,38 мкмоль/г белка (рис. 2C).

Рисунок 2 . Биохимический анализ проводили на экстрактах каллусов, выращенных на среде Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением различных концентраций ПФ-68 без фитогормонов (МСО). Контроль (MSO), оптимальный (MSO +0,04% PF-68) и высокий (MSO +0,10% PF-68). (A) Общий растворимый сахар; (B) содержание общего белка; (C) Активность глутаматсинтазы (GOGAT). Данные показывают среднее значение трех биологических повторов. Звездочки (*) указывают на то, что значения значительно отличались от значений контрольного каллюса при p <0.05. Столбики погрешностей представляют стандартное отклонение для трех биологических повторностей.

Кроме того, связанные со стрессом биохимические оценки, проведенные для изучения механизма, лежащего в основе индукции PF-68 в высокой концентрации, показали, что самая высокая активность PAL была обнаружена в каллусе, выращенном на 0,10% PF-68 (0,28 ЕД/мкг белка) (Рисунок 3A), что подтверждается самым высоким содержанием MDA 0,024 ЕД/мкг белка (Рисунок 3B) и самой высокой пероксидазной активностью 0,15 ЕД/мкг белка (Рисунок 3C). При определении эстеразной активности каллусы, выращенные на 0.Было зафиксировано, что 10% PF-68 имеет самую низкую эстеразную активность (34 204,50 нмоль/нг белка) по сравнению с 0,04% PF-68 (35 091,67 нмоль/нг белка) и контролем (37 620,17 нмоль/нг белка) (рис. 3Д).

Рисунок 3 . Биохимический анализ проводили на экстрактах каллусов, выращенных на среде Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением различных концентраций PF-68 без растительных гормонов (MSO). Контроль (MSO), оптимальный (MSO +0,04% PF-68) и высокий (MSO +0,10% PF-68). (A) Активность фенилаланинлиазы (PAL); (B) содержание малонового диальдегида (МДА); (C) активность пероксидазы; (D) Эстеразная активность.Данные показывают среднее значение трех биологических повторов. Звездочки (*) указывают на то, что значения значительно отличались от значений контрольного каллюса при p <0,05. Столбики погрешностей представляют SD трех биологических повторностей.

Анализ содержания питательных ионов в каллюсе MR 219, обработанном PF-68

Наличие питательных веществ имеет решающее значение для роста и развития растений. Чтобы оценить влияние PF-68 на поглощение питательных веществ каллусом MR 219, был проведен анализ ионов питательных веществ с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии .Из таблицы 1 видно, что каллусы, выращенные на 0,04 % ПФ-68, содержали большее количество макроэлементов (K, Mg и Ca) и микроэлементов (Fe, Zn, Cu и Mn), за исключением Na, который имел такое же количество по сравнению с контроль. Однако каллусы, выращенные на 0,10 % ПФ-68, содержали большее количество Ca, Fe, Zn, Cu и Mn по сравнению с контролем. Среди протестированных макро- и микроэлементов K имел самый высокий прирост, обнаруженный в 0,04% PF-68 (42 600 частей на миллион) по сравнению с контролем (40 600 частей на миллион).

Таблица 1 .Концентрация содержания питательных ионов в контрольном каллусе и каллусе с добавлением 0,04% ПФ-68 и 0,10% ПФ-68 через 4 недели инкубации.

Сравнительный протеомный анализ каллуса MR 219, обработанного PF-68

Был проведен сравнительный протеомный анализ между контролем, оптимальной (0,04%) и высокой концентрацией (0,10%) PF-68, чтобы пролить свет на возможную роль PF-68 в росте костной мозоли. Дифференциально экспрессируемые белки были идентифицированы в трех разных сравниваемых группах; а именно, между контролем и оптимальной концентрацией, контролем и высокой концентрацией, оптимальной и высокой концентрацией.Значения корреляции Пирсона в этих трех группах имели высокую степень достоверности, что указывало на то, что образцы, использованные между различными группами лечения, были линейно связаны (дополнительная фигура 1). Кроме того, анализ основных компонентов показал хорошее разделение между группами лечения, что указывает на значительные изменения в протеомном изобилии между каждой группой (дополнительная фигура 1).

Всего было успешно идентифицировано 337 белков из контроля, 353 белка из оптимальной концентрации и 288 белков из высокой концентрации (рис. 4А).В общей сложности 251 аналогичный белок был общим для трех групп лечения. При сравнении контрольной и оптимальной концентраций в этих двух обработках было идентифицировано всего 380 белков. Всего было идентифицировано 315 белков как в контроле, так и в высоких концентрациях. При сравнении оптимальных и высоких концентраций в обеих обработках было идентифицировано в общей сложности 320 белков. На основании анализа 49 белков активировались, а 62 белка подавлялись в оптимальной концентрации по сравнению с контролем (рис. 4B; дополнительная рис. 1 и дополнительная таблица 2).При сравнении контроля и высоких концентраций было обнаружено, что 13 белков активировались, а 19 белков подавлялись (рис. 4B; дополнительная рис. 1 и дополнительная таблица 3). В общей сложности 36 белков были активизированы, а 48 белков были подавлены в оптимуме по сравнению с высокой концентрацией PF-68 (рис. 4B; дополнительная фигура 1 и дополнительная таблица 4). Кроме того, 37 белков были исключительными для оптимальной концентрации, а 43 белка были исключительными для контроля при сравнении контрольной и оптимальной концентраций.В общей сложности 18 белков были исключительными для высокой концентрации, а 48 белков были исключительными для контроля при сравнении между контролем и высокими концентрациями. При сравнении оптимальной и высокой концентрации 59 белков были исключительными для оптимальной концентрации, а 23 белка были исключительными для высокой концентрации (рис. 4В). Идентифицированные дифференциально экспрессируемые белки были подвергнуты анализу пути Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), который показал, что добавка PF-68 влияет на белки, которые участвуют в метаболизме углеводов, биосинтезе аминокислот, биосинтезе белков и биосинтезе вторичных метаболитов (рис. 4C). ).Кроме того, наблюдалось, что экспрессия генов выбранных белков имеет аналогичную тенденцию с профилем протеома (дополнительная фигура 2).

Рисунок 4 . Сравнительный протеомный анализ экстрактов каллусов, подвергшихся воздействию различных концентраций ПФ-68. Контрольный (0% PF-68), оптимальный (0,04% PF-68) и высокий (0,10% PF-68). (A) Диаграмма Венна для общего количества белков, полученная в результате сравнения трех обработок. (B) Всего дифференциально экспрессируемых белков, идентифицированных в трех группах лечения. (C) Анализ пути KEGG дифференциально экспрессируемых белков, выявленных в трех группах лечения.

Обсуждение

Свойство неподатливости сортов риса indica было одним из основных препятствий в регенерации in vitro MR 219, особенно плохой индукции каллюса и пролиферации. Были предприняты различные попытки улучшить регенерацию MR 219 in vitro , такие как применение растительных добавок в культуральной среде (Low et al., 2019). Недавнее исследование применения PF-68 успешно улучшило скорость пролиферации каллюса у MR 219 в присутствии растительных гормонов (Kok et al., 2020). Следовательно, настоящее исследование было предпринято для дальнейшего выяснения механизмов, управляющих ответом PF-68, стимулирующим рост, во время пролиферации мозолей.

Применение только оптимальной концентрации PF-68 без добавления растительного гормона улучшило пролиферацию каллуса риса MR 219 (рис. 1). Эти наблюдения согласуются с предыдущим исследованием применения PF-68 в присутствии растительных гормонов (Kok et al., 2020). Это говорит о том, что PF-68 может действовать как добавка для роста независимо от гормонов роста растений.

Обнаружено, что применение ПФ-68 адсорбируется на поверхности клеток, обеспечивая защиту от физических и химических стрессов в культуре клеток животных. Взаимодействие между PF-68 и проницаемостью мембран было изучено на дрожжах, культурах клеток животных и культурах клеток растений (King et al., 1991; Meier et al., 1999; Cho et al., 2007). Было показано, что включение PF-68 в низкой концентрации влияет на проницаемость мембраны (King et al., 1991). Было высказано предположение, что благодаря повышенной проницаемости мембраны PF-68 может способствовать поглощению питательных веществ и росту клеток в культуре клеток животных (Shelat et al., 2013).

Молекулы растворимого сахара, такие как сахароза, глюкоза и фруктоза, играют важную роль в восприятии сахара и развитии растений. Высокое содержание сахара может способствовать росту клеток и накоплению углеводов за счет производства углерода и энергии, необходимых для роста и развития растений (Eveland and Jackson, 2012). Крахмал, разветвленный полимер глюкозы, также функционирует в растениях как запасной углевод (Tetlow and Emes, 2014).В настоящем исследовании накопление растворимого сахара наблюдалось в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68 (рис. 2А). Аналогичные результаты были получены при применении PF-68 во время роста каллуса S. dulcamarain (Kumar et al., 1992). В ответ на PF-68 повышенное накопление растворимого сахара отражалось в увеличении массы ткани S. dulcamarain (Kumar et al., 1992). Кроме того, сравнительный протеомный анализ показал, что белок цитозольной инвертазы 1 оказался исключительным в каллусе, обработанном оптимальным PF-68 (дополнительные таблицы 2, 4).В растениях инвертаза играет жизненно важную роль в гидролизе сахарозы на глюкозу и фруктозу, а также в обеспечении снабжения углеродными питательными веществами, необходимыми для клеточного биосинтеза и передачи сигналов сахара (Ruan et al., 2010). Например, было показано, что точечная мутация гена цитозольной инвертазы 1 в Arabidopsis вызывает накопление сахарозы и снижение роста растений (Qi et al., 2007). В другом исследовании сообщалось, что мутантный ген цитозольной инвертазы 1 проявлял задержку цветения и частичную стерильность у риса (Jia et al., 2008). Обнаружение белка инвертазы, обнаруженного исключительно в каллюсе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68, свидетельствует об усилении образования глюкозы и фруктозы из сахарозы.

Кроме того, в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией ПФ-68, обнаружено увеличение содержания изофермента альфа-амилазы 3А (табл. 2). Во время углеводного обмена альфа-амилаза вырабатывается в изобилии, и это важный фермент растений, катализирующий гидролиз альфа-1,4-глюкозидных связей в крахмале (Zeeman et al., 2010). В растениях разложение крахмала часто зависит от наличия углерода. Например, расщепление крахмала прекращалось при высокой доступности углерода, тогда как расщепление крахмала стимулировалось при обнаружении низкой доступности углерода в растениях (Weise et al., 2006). В подтверждение этого было обнаружено, что фермент, разветвляющий 1,4-альфа-глюкан, содержится в небольшом количестве в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68 (дополнительные таблицы 2, 4). Фермент разветвления крахмала (SBE), такой как фермент разветвления 1,4-альфа-глюкана, является одним из основных ферментов, участвующих в биосинтезе крахмала в растениях.Этот SBE может влиять на структуру крахмала с точки зрения частоты и длины разветвленной цепи (Tetlow and Emes, 2014). Таким образом, снижение содержания SBE, зарегистрированное в каллюсе, обработанном оптимальной концентрацией PF68, свидетельствует о значительном снижении производства крахмала. Это еще раз подтверждает, что углеводный обмен был усилен, чтобы обеспечить постоянный запас энергии и углерода для роста и развития растений (Zeeman et al., 2010).

Таблица 2 .Топ-20 белков, демонстрирующих значительную разницу в распространенности (вместе с их инвентарными номерами) между контрольной и оптимальной концентрациями PF-68.

Помимо накопления растворимых сахаров, важную роль в процессе роста и развития растений также играет накопление общего белка. Накопление белков в растении часто зависит от наличия азота. Азот является одним из основных строительных блоков аминокислот. Во многих природных средах азот часто является одним из ограничивающих питательных веществ, а снижение доступности азота часто является причиной замедления роста растений.В настоящем исследовании повышенная активность GOGAT и увеличение количества белка NADH-GOGAT были обнаружены в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68 (рис. 2C и дополнительная таблица 2). У растений GOGAT является одним из ключевых белков, участвующих в биосинтезе аминокислот, в частности в метаболизме азота. Изоферменты GOGAT катализируют перенос амидо-азота глутамина в 2-оксоглутарат с использованием либо пиридиновых нуклеотидов (зависимых от НАДН), либо ферредоксина (зависимых от ферредоксинов) в качестве восстановителя (Konishi et al., 2014). Кроме того, Чичкова с соавт. (2001) ранее сообщали, что сверхэкспрессия гена NADH-GOGAT в трансгенном растении табака увеличивает сухую массу и общее содержание углерода и азота. Повышенная активность GOGAT и повышенное количество белка NADH-GOGAT, как наблюдалось, представляют собой когерентное накопление общих белков в каллюсе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68 (рис. 2). Это свидетельствует о том, что внесение 0,04% ПФ-68 может играть активную роль в ассимиляции азота в каллусе.Затем повышенное содержание азота будет использоваться в качестве источника строительных блоков для аминокислот и впоследствии усилит биосинтез белков, которые имеют решающее значение для роста растений (Rafiq et al., 2010).

Дальнейший сравнительный анализ протеома выявил увеличение количества рибосомных белков (60S рибосомный белок L10a и 40S рибосомальный белок S21), обнаруженных в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68, по сравнению с контролем и высокой концентрацией PF-68 (таблица 3).Рибосомные белки хорошо известны своей ролью в обеспечении синтеза белка и поддержании стабильности рибосомного комплекса. Комплекс рибосом в целом обеспечивает правильное протекание в клетках процессов инициации синтеза белка, сборки аминокислот и терминации (Moin et al., 2016). Регуляция рибосомных белков зависит от развития. Например, высокие уровни рибосомных белков были обнаружены в растительных тканях с активной активностью деления (Ferreyra et al., 2010). Ито и др. (2000) сообщили, что разрушение рибосомных белков привело к дефектам развития Arabidopsis , таким как аберрантный лист, замедленный рост корней и позднее цветение. Следовательно, увеличение количества рибосомных белков, обнаруженное в каллусе, обработанном оптимальной концентрацией PF-68, может играть важную роль в процессе роста и развития клеток. Кроме того, аналогичные результаты были получены при применении PF-68 на S. dulcamarain , при этом во время роста каллуса наблюдалось усиленное накопление белка (Kumar et al., 1992).

Таблица 3 . Топ-20 белков, демонстрирующих значительную разницу в количестве (вместе с их инвентарными номерами) при сравнении между контролем и высокими концентрациями PF-68.

Основные питательные вещества для растений можно разделить на макро- и микроэлементы. Результаты, полученные в этом исследовании, показали, что каллюс, обработанный оптимальной концентрацией PF-68, имел более высокое количество макроэлементов (K, Mg и Ca) и микроэлементов (Fe, Zn, Cu и Mn) по сравнению с контролем (таблица 1).Наблюдаемое увеличение поглощения питательных веществ может быть связано с повышенной проницаемостью мембраны в ответ на PF-68. Среди протестированных питательных веществ для растений калий является важным питательным веществом и играет жизненно важную роль в росте и развитии растений, что подтверждается максимальным поглощением калия при оптимальной концентрации PF-68. Он участвует в биохимических процессах, включая синтез белка и углеводный обмен (Wang et al., 2013). Фауст и Шуберт (2016) ранее сообщали, что содержание белка и сахара в сахарной свекле было значительно снижено из-за дефицита калия.Кроме того, также наблюдалось накопление предшественников белка, таких как аминокислоты и амиды, что позволяет предположить, что дефицит калия может ингибировать синтез белка. Зелелев и др. (2016) также сообщили, что повышение уровня K оказало значительное влияние на растения, в результате чего высота растения, количество надземных стеблей и количество листьев на растении увеличились у изученного ими сорта картофеля. Таким образом, поддержание баланса уровня K в растениях имеет решающее значение для роста и развития растений. Задержка роста, плохая корневая система, полегание, снижение урожайности и пожелтение листьев также были обычными явлениями, которые наблюдались у растений с дефицитом калия (Wang et al., 2013). Кроме того, дефицит калия повышает восприимчивость растений к различным заболеваниям и заражению вредителями, делая растения более восприимчивыми к повреждениям в различных стрессовых условиях (Hasanuzzaman et al., 2018). Основываясь на результатах, полученных в таблице 1, повышенное поглощение питательных веществ, особенно калия, может быть одним из эффектов PF-68, который способствовал увеличению скорости пролиферации каллюса MR 219.

Вторичные метаболиты растений представляют собой многочисленные химические соединения, продуцируемые растительными клетками посредством метаболических путей, происходящих от первичных метаболических путей.Фенольные и флавоноидные соединения представляют собой самую большую группу вторичных метаболитов в растениях и играют важную роль в опосредовании реакции растений на биотические и абиотические стрессы (Park et al., 2018). В этом исследовании в каллюсе, обработанном высокой концентрацией PF-68, было зарегистрировано увеличение количества белков PAL (таблица 3 и дополнительная таблица 4) и высокая активность PAL (рис. 3A). PAL катализирует первую реакцию биосинтеза аммиака и трансциннамата из фенилаланина.Затем продукт далее трансформируется в широкий спектр натуральных фенилпропаноидных продуктов, включая фенолы, флавоноиды, лигнин и фитоалексины (Jun et al., 2018). PAL имеет решающее значение для роста и развития растений, поскольку он отвечает за производство вторичных метаболитов в ответ на сигналы окружающей среды, включая УФ-облучение, воздействие тяжелых металлов, инфекции, ранения, низкие температуры и низкие уровни азота, фосфата или ионов (Zhang и Лю, 2015). В настоящем исследовании увеличение активности PAL означало, что биосинтез вторичных метаболитов усиливался в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68.Примечательно, что усиление появления коричневых каллусов, наблюдаемое при высокой концентрации PF-68, также может быть связано с накоплением биосинтеза вторичных метаболитов (рис. 1В).

Лигнин представляет собой сложный фенольный полимер, участвующий в росте и развитии растений в качестве одного из основных компонентов вторичной стенки. Он также обеспечивает механическую прочность клеточной стенки и играет важную роль в защитном механизме от биотических и абиотических стрессов (Vanholme et al., 2010).Об усилении лигнификации клеточных стенок широко сообщалось у растений при воздействии стрессов окружающей среды. Например, адаптация растений к солевому стрессу привела к значительному увеличению содержания лигнина в сосудистых тканях и утолщению клеточной стенки (Chun et al., 2019). В этом исследовании было обнаружено, что белок коричной алкогольдегидрогеназы (CAD) является исключительным в каллюсе, обработанном высокой концентрацией PF-68, по сравнению с оптимальной концентрацией PF-68 (дополнительная таблица 4). Этот CAD был широко охарактеризован, и известно, что он играет роль в биосинтезе лигнина посредством превращения фенилпропениловых альдегидов в спирты (Ma et al., 2018). Было показано, что подавление CAD снижает содержание лигнина и изменяет состав лигнина в просе (Fu et al., 2011). Основываясь на этих результатах, присутствие белка CAD, эксклюзивного для каллюса, обработанного высокой концентрацией PF-68, позволяет предположить, что биосинтез лигнина усиливался в ответ на увеличение стресса, вызванного высокой концентрацией PF-68.

Активные формы кислорода (АФК) являются одним из побочных продуктов аэробного метаболизма. Перекисное окисление липидной мембраны является одним из повреждающих эффектов АФК.В процессе перекисного окисления липидов мембраны АФК удаляют электроны из липидов в клеточной мембране, разрушая систему клеточных мембран растения. Усиление перекисного окисления липидов мембран вызывает увеличение проницаемости мембран растения, что в конечном итоге вызывает утечку электролитов в растительной клетке (Campo et al., 2014). Результаты, полученные в этом исследовании, показали, что повышенное содержание МДА было зафиксировано в 0,10% PF-68 (рис. 3В). МДА является основным продуктом перекисного окисления липидов и отражает степень перекисного окисления липидов в растительных клетках в ответ на стресс (Song et al., 2016). Аналогичные значительные уровни перекисного окисления липидов были обнаружены у лесных деревьев (Zhou et al., 2014) и рапса (Jin et al., 2010) в ответ на абиотические стрессы. Значительное повышение уровня МДА свидетельствует о тяжелом окислительном повреждении клеточной мембраны растений. Однако исследования показали, что перекисное окисление липидов является распространенным явлением, возникающим в растительных клетках при воздействии стресса. МДА часто использовали в качестве маркера для определения физиологического состояния растения во время роста (Talbi et al., 2015; Конг и др., 2016). В этом исследовании высокий уровень МДА был обнаружен при высокой концентрации PF-68, что свидетельствует об окислительном повреждении клеточной мембраны. Это наблюдение может подтвердить предыдущую гипотезу о высокой концентрации PF-68, согласно которой высокая концентрация PF-68 вызывает вредные и необратимые изменения в плазматической мембране растительных клеток (Curtis, Mirkov, 2012; Irshad et al., 2018).

Наряду с повышенным содержанием МДА в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68, также было обнаружено увеличение количества белков, участвующих в системе антиоксидантной защиты, таких как белок пероксидазы и белки пероксиредоксина (таблица 4 и дополнительная таблица 4). .Соответственно, биохимическая оценка выявила аналогичную высокую активность пероксидазы в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68 (рис. 3C). Выявленные низкие уровни АФК обычны для растений, поскольку АФК являются побочным продуктом аэробного метаболизма растений. Более того, АФК служат важной сигнальной молекулой для регуляции физиологических процессов (Wang et al., 2016). Однако накопление АФК может привести к чрезмерному повреждению макромолекул и растительных клеток, что в конечном итоге вызывает реакцию гиперчувствительности и запрограммированную гибель клеток (PCD) в растительных клетках (Konieczny et al., 2014). Чрезмерному производству АФК часто способствует усиление реакции на стресс (Konieczny et al., 2014). Для регулирования внутриклеточных уровней АФК в растениях необходимы ферменты, удаляющие АФК, такие как каталаза, пероксиредоксин и пероксидаза (Chou et al., 2012). Повышенный синтез белков пероксидазы и пероксиредоксина, обнаруженный в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68, показал, что регуляция АФК усиливалась в ответ на усиление окислительного стресса, вызванного высокой концентрацией PF-68.

Таблица 4 . Топ-20 белков, демонстрирующих значительную разницу в распространенности (вместе с их инвентарными номерами) при сравнении между оптимальными и высокими концентрациями PF-68.

Помимо обилия белка в растениях, эстераза может использоваться для определения жизнеспособности клеток. В нескольких исследованиях изменения активности эстеразы использовались в качестве маркера для изучения характеристик роста и жизнеспособности клеток растений (Amano et al., 2003; Tamás et al., 2005; Viteček et al., 2007). В некотором смысле снижение активности эстеразы у растений соответствует снижению жизнеспособности клеток у растений. Кроме того, активность эстеразы также может служить отличным биоиндикатором стрессов окружающей среды (Radić and Pevalek-Kozlina, 2010). В настоящем исследовании снижение эстеразной активности при высокой концентрации PF-68 может быть связано со снижением жизнеспособности клеток каллусов. Эта ассоциация была подтверждена увеличением количества черных каллусов, зарегистрированных при высокой концентрации PF-68 (рис. 1В).Снижение жизнеспособности клеток, скорее всего, было связано с накоплением АФК (рис. 2С) и неспособностью системы удаления АФК справляться с нарастающим стрессом, вызванным высокой концентрацией PF-68, что в конечном итоге вызвало ПКС в клетках каллуса (рис. 2С). Рисунок 3D).

Выводы

Несмотря на то, что стимулирующие рост эффекты PF-68 были известны, механизм, регулирующий стимулирующие рост эффекты, остается в значительной степени фрагментированным. Настоящее исследование демонстрирует, что стимулирующие рост эффекты PF-68 не зависят от растительного гормона.Сравнительный анализ протеома показал, что оптимальная концентрация PF-68 усиливала пролиферацию каллуса у сорта MR 219 за счет усиления накопления сахара и биосинтеза белка. Об этом свидетельствует увеличение количества белков, связанных с углеводным обменом, рибосомных белков и белков, связанных с азотным обменом (рис. 5). Более того, оптимальная концентрация PF-68 увеличивала поглощение питательных веществ каллусом, особенно калия, что указывает на жизненно важную роль калия в росте и развитии растений.Однако каллюс, обработанный высокой концентрацией PF-68, показал повышенный уровень реакции на стресс, так что были обнаружены высокие уровни активности PAL, содержания MDA и активности пероксидазы (рис. 5). Соответственно, повышенное количество белка PAL и белков, участвующих в системе антиоксидантной защиты, также было обнаружено в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68. Кроме того, сниженный уровень активности эстеразы, обнаруженный в каллусе, обработанном высокой концентрацией PF-68, позволяет предположить, что усиливающаяся реакция на стресс в конечном итоге запускает PCD.В совокупности механизм стимуляции роста PF-68 зависит от концентрации, и включение PF-68 в различных концентрациях может либо способствовать росту растений, либо вызывать стресс.

Рисунок 5 . Предложен механизм роли PF-68 в пролиферации костной мозоли. CAD, дегидрогеназа коричного спирта; GOGAT, глутаматсинтаза; МДА, малоновый диальдегид; NADH-GOGAT, NADH-зависимая глутаматсинтаза; PAL, фенилаланинаммиаклиаза; АФК, активные формы кислорода; SBE, фермент разветвления крахмала; ↑, увеличилось; ↓, уменьшилось.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам. Обработанные протеомные данные можно найти в дополнительных материалах.

Вклад автора

K-SL и JO-A задумали и разработали эксперименты. AK провел исследование, проанализировал данные и написал рукопись. NM, RS, C-YW и DL внесли свой вклад в приобретение аналитических инструментов/реагентов/финансирования.Все авторы прочитали, внесли свой вклад и одобрили рукопись.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Схему грантов на фундаментальные исследования (FRGS/1/2014/SG05/MOSTI/1), стипендию UPM для выпускников и гранты UPM Putra (GP-IPS/2017/9572000) для финансирования исследований.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.667434/full#supplementary-material

Лист данных 1. 0,04% PF-68.

Лист данных 2. 0,10% PF-68.

Лист данных 3. Контроль.

Лист данных 4. Протеомный анализ Perseus на Pluronic F-68.

Спецификация 5. Дополнительные таблицы и рисунки.

Лист данных 6. Анализ протеомных данных.

Сокращения

CAD, дегидрогеназа коричного спирта; DW, сухой вес; FW, свежий вес; GOGAT, глутаматсинтаза; МДА, малоновый диальдегид; М.С., Мурасиге и Скуг; MSO, Murashige и Skoog без регуляторов роста растений; PAL, фенилаланинаммиаклиаза; ПФ-68, Плюроник Ф-68; АФК, активные формы кислорода; SBE, фермент разветвления крахмала.

Каталожные номера

Абири Р., Мазия М., Шахаруддин Н.А., Юсоф, З.Н.Б., Атабаки, Н., Ханафи, М.М., и соавт. (2017). Усиление соматического эмбриогенеза малазийского сорта риса MR219 с использованием адъювантных материалов в высокоэффективном протоколе. Междунар. Дж. Окружающая среда. науч. Технол . 14, 1091–1108. doi: 10.1007/s13762-016-1221-y